吖啶橙染色液一般用作什么检查-吖啶橙染色步骤

1、临床标本：宫颈分泌物，取自医院门诊妇产科就诊的非特异性阴道炎(NSV)患者，常规消毒用无菌棉签自宫颈口取分泌物于无菌生理盐水管中。

2、革兰染色法：取无菌生理盐水中的宫颈或阴道分泌物直接涂片，常规革兰染色，找到线索细胞者为阳性。

3、吖啶橙染色荧光法：取无菌生理盐水中的宫颈或阴道分泌物直接涂片，自然干燥，火焰固定，0.1 mmol/L吖啶橙染色37℃30 min，用0.01 mol/L PBS冲洗2次，0.01 mmol/L 氯化钙分色1 min，用0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗1次，甘油封片，荧光显微镜观察结果。在上皮细胞中发现成堆桔**细小杆菌为阳性。

4、分离培养鉴定法：将无菌生理盐水中的阴道或宫颈分泌物，以无菌手续接种于阴道加德纳菌专用分离培养基上，置5%二氧化碳培养箱37℃孵育48 h，挑取灰色、半透明、光滑、露滴状样菌落，如为革兰染色阴性小杆菌者，进行生化鉴定，生化鉴定标准按文献进行鉴定。

5、PCR检测法：(1)根据Belkum等报道加德纳菌位于IIS-23srRNA基因区为特异性引物序列，扩增片段：433bp。引物15′-TTTCGTGGAGGGTTCGATTCTGG-3′引物2 5′-TACA-AGCTGATAGGACGCG-3′由上海生物工程公司合成。(2)临床标本模板DNA的制备：将宫颈分泌物500μl生理盐水中，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加碱性裂解液，98℃10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液做模板。(3)PCR扩增和产物检测：反应总体积为25μl，包括10×PCR缓冲液2.5 μl，4×dNTP 1.5 μl，引物1，2各0.25 μl，无菌去离子水9.5μl，模板10 μl，Taq DNA聚合酶1 U/μl，以无菌石蜡油30 μl覆盖，进入PCR循环，循环参数为:95℃5 min，94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，32个循环，最后72℃延伸5 min。取扩增产物15 μl，于2%琼脂糖(含EB液)上100 V电泳30 min，于紫外光下观察结果，出现433 bp扩增带者为阳性，未见433 bp扩增带为阴性。 1、革兰染色找线索细胞仍是一种诊断细菌性阴道病的常规方法。

异染性染料，吖啶橙以插入方式与病原体双螺旋DNA分子结合，根据病原体DNA或RNA对吖啶橙染料的吸附方式不同所放射的荧光也不同，再加上加德纳菌在侵袭的靶目标为上皮细胞聚集，当吖啶橙染色后在荧光照射下，发射出桔红色荧光，能清晰地检测出加德纳菌在上皮细胞上的聚集现象，作出精确的诊断。

3、分离培养鉴定法是国际确认的金指标，临床上由于不正规的应用抗生素，导致许多病原体在一定程度上受到抑制，给分离培养带来困难，造成分离培养阴性结果，建议做分离培养应取材于治疗前的标本，需要专用的高营养的培养基，以提高分离培养的阳性检出率。

4、PCR技术具有高度的特异性和敏感性，选用特异的寡核苷酸引物序列，检测目的是病原体的遗传物质DNA不受抗生素治疗等药物治疗的影响，对彻底根治病原体有着极其重要的意义。

什么DNA RNA PCR

用作荧光指示剂，肿瘤细胞及细菌、核酸染色剂及移码突变的诱变剂。

吖啶橙是一种荧光色素，吖啶橙激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。吖啶橙与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。

淋巴丝虫病的检查

RNA与DNA最重要的区别一是RNA只有一条链，二是它的碱基组成与DNA的不同，RNA没有碱基T（胸腺嘧啶），而有碱基U（尿嘧啶）。所以导致他们有以下性质上的不同。

1.两性解离：DNA无，只有酸解离，碱基被屏蔽（在分子内部形成了H键）。RNA有，有PI。

2.粘度大：DNA;RNA，粘度由分子长度/直径决定，DNA为线状分子，RNA为线团。

3.碱的作用：DNA耐碱RNA易被碱水解。

4.显色反应：

鉴别DNA和RNA+浓HCl RNA ------→ 绿色化合物

DNA ------→ 蓝紫色化合物苔黑酚

二苯胺啡啶溴红（荧光染料）和溴嘧啶都可对DNA染色，原理是卡在分子中，DNA的离心和电泳显色可用它们。

DNA和RNA的鉴别染色

利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果，但该方法已被许多实验室广泛采用。

5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇，因此，常用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而RNA不溶，故可用苯酚来沉淀RNA。

6.紫外吸收：核酸的λm＝260nm，碱基展开程度越大，紫外吸收就越厉害。当A＝1时，DNA：50ug/ml，RNA和单链DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。用A260/A280还可来表示核酸的纯度。

7.沉降速度：对于拓扑异构体（核苷酸数目相同的核酸），其沉降速度从达到小依次为：RNA ; 超螺旋DNA > 解链环状DNA ; 松弛环状DNA ; 线形DNA也就是在离心管中最上层是线形DNA，最下面是RNA。

8.电泳：核苷酸、核酸均可以进行电泳，泳动速度主要由分子大小来决定，因此，电泳是测定核酸分子量的好方法。

9.DNA分子量测定最直接的方法：用适当浓度的EB（溴嘧啶）染色DNA，可以将其他形式的DNA变成线形DNA，用电镜测出其长度，按B-DNA模型算出bp数，根据核苷酸的平均分子量就可计算出DNA的分子量。

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR技术简史

PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之 间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的 60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

PCR技术基本原理

PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情 况下，平台期的到来是不可避免的。

PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没 有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合 时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系：

10×扩增缓冲液 10ul

4种dNTP混合物 各200umol/L

引物 各10～100pmol

模板DNA 0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+ 1.5mmol/L

加双或三蒸水至 100ul

PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接 用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

PCR反应条件的选择

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

复性温度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

PCR反应特点

特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；

④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR扩增产物分析

PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。

琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。

酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。

分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。

Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。

斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

1.白细胞计数与分类

早期有过敏反应的患者白细胞总数与嗜酸性粒细胞增加，前者大多在（10～20）×10/L之间，后者在20%以上。如有细菌继发感染除白细胞总数增加外中性粒细胞亦显著增加。

2.血液微丝蚴的发现

丝虫病的确诊有赖于微丝蚴的发现，通常采用外周血液的检查，大多自夜10时至次晨2时微丝蚴最易找到，如夜间血中超出150条/60μl，白昼亦可找到。

（1）鲜血法用血红蛋白计吸管吸取耳垂血20μl，在低倍显微镜下找微丝蚴。阳性者可见微丝蚴自由摆动，前后卷曲，颇为活跃。

（2）涂片法耳垂取血三大滴（约等于60μl）置于玻片中心，涂成厚薄均匀边缘整齐的长方形或椭圆形厚血片约2cm×3cm大小自20世纪80年代起，又统一规定为120μl即六大滴双片法。染色可用品蓝或硼砂亚甲蓝染色法如鉴别虫种有困难时可用吉姆萨或苏木精染色。采用荧光色素吖啶橙染色法，亦可提高微丝蚴检出率。

（3）浓集法微丝蚴的浓集法很多都是将血液内的红细胞溶解后，离心沉淀吸取沉渣寻找被集中在沉渣内的微丝蚴。常用的溶血剂为蒸馏水。

（4）微孔膜过滤法用含有5%枸橼酸钠0.1ml的10ml注射器抽血1m1混匀，再吸10%teepol液9ml（或2%吐温80液或0.1%碳酸氢钠液）混匀溶血，将注射器接25mm直径的5μm孔径微孔膜过滤器，溶血液通过薄膜滤下，微丝蚴留于薄膜上，取下薄膜用0.1%苏木精或0.1%亚甲蓝染色后镜检。

（5）微丝蚴白天诱出法在白天口服乙胺嗪100mg后1小时内微丝蚴可以在外周血液内查到。本法不宜作普查丝虫病的方法。在门诊检查，可作参考。

3.各种体液微丝蚴检查

鞘膜积液、乳糜尿、淋巴或乳糜腹水、心包积液、眼前房水等液体中检查微丝蚴，可用直接涂片、染色镜检或离心浓集法检查

4.免疫学诊断

目前国内外常用的免疫学诊断方法有：

（1）皮内试验注射犬恶丝虫抗原0.05ml于受试者前臂皮内，15min后丘疹超过0.9cm者为阳性。此试验与丝虫病患者体征符合率为73.6%～96.6%，与血中带微丝蚴阳性符合率为86.2%～94.1%，但与血吸虫病可产生轻度交叉反应本法只具过筛及辅助诊断价值，在防治后期也不宜用于监测。

（2）间接免疫荧光抗体试验以长爪沙鼠等动物模型收集的成虫和微丝蚴作抗原，荧光抗体采用羊抗人IgG荧光抗体结合物，具有高度敏感性和特异性。以成虫切片作抗原，其敏感性为92%～98%，特异性为95%；以微丝蚴切片作抗原，敏感性达92%～96%特异性为98%。本法可作为丝虫病辅助诊断和血清流行病学调查与现场监测。缺点仍是不能用于疗效考核，及区别患者属于既往感染或活动感染。

（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）采用马来丝虫、犬恶丝虫、指状腹腔丝虫及微丝蚴等可溶性抗原，ELISA测定抗体，与丝虫病患者的阳性符合率为85%～100%，假阳性反应为1.5%～8.2%。用微丝蚴或成虫ES抗原对微丝蚴血症者阳性符合率为93%～95%，非流行区健康人及肠道线虫感染者均为阴性反应。本法检测人体丝虫病抗体，具有较高特异性和敏感性，适用于现场调查同样本法不能用于疗效考核及区别患者是否为活动性感染

（4）检测循环抗原WHO推荐应用免疫色谱技术（ICT）测试卡检测班氏丝虫抗原。据报告该法敏感性为90%～98%，特异性达99%～100%。

用单克隆抗体酶联免疫吸附试验（McAbELISA）和斑点酶联法（Dot－ELISA）检测丝虫病患者血清中抗原，特异性分别为94%和96%，Dot－ELISA可检出0.055μg/L抗原，而McAbELISA仅能检出10μg/L抗原。两者均能检出活动性感染作为丝虫病防治的后期监测、搜索残存传染源和评价防治效果。

5.分子杂交及DNA重组技术

目前基因克隆和DNA技术正应用于丝虫病诊断，具有很高的敏感性和特异性。

6.乳糜尿与淋巴尿

乳糜尿与淋巴尿，前者呈乳白色，可用提取，以苏丹Ⅲ染色，在显微镜下可见红**油点淋巴尿的肉眼检查与正常尿无异，其含量以蛋白质为主，也有少数红细胞，但无管型。自鞘膜积液穿刺而得的乳糜液与淋巴液，与乳糜尿及淋巴尿大致相同，自其沉淀中可发现活动的微丝蚴。

7.活组织检查

将疑似的病变组织，如下肢浅表淋巴结、附睾结节切取小块，进行病理检查，可找到成虫及可见相关的病理变化。

8.其他辅助检查

淋巴管造影：丝虫病患者常显示扩张的输入淋巴管和狭小的输出淋巴管，淋巴结实质显影有缺损现象。