吖啶橙荧光染色试剂盒-吖啶橙荧光染色原理

2024-10-18 00:25:46

第一种方法最常用

1）紫外吸收法也就是测量OD（260）和OD（280）的吸收值,这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点,因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收.

（2）荧光法,用PicoGreen荧光染料,测定DNA,RNA浓度比较灵敏,并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA,并且受其它杂质的影响不大,缺点要有专门的荧光检测仪器,试剂比较昂贵.

纯化DNA可以买试剂盒,主要有膜吸附法,磁珠分离法,都很方便.

RNA与DNA最重要的区别一是RNA只有一条链,二是它的碱基组成与DNA的不同,RNA没有碱基T（胸腺嘧啶）,而有碱基U（尿嘧啶）.所以导致他们有以下性质上的不同.

1.两性解离：DNA无,只有酸解离,碱基被屏蔽（在分子内部形成了H键）.RNA有,有PI.

2.粘度大：DNA;RNA,粘度由分子长度/直径决定,DNA为线状分子,RNA为线团.

3.碱的作用：DNA耐碱RNA易被碱水解.

4.显色反应：

鉴别DNA和RNA+浓HCl RNA ------→ 绿色化合物

DNA ------→ 蓝紫色化合物苔黑酚

二苯胺啡啶溴红（荧光染料）和溴嘧啶都可对DNA染色,原理是卡在分子中,DNA的离心和电泳显色可用它们.

DNA和RNA的鉴别染色

利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA.吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定,非固定细胞核酸,或作溶酶体的一种标记.观察亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体.虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果,但该方法已被许多实验室广泛采用.

5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇,因此,常用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA.DNA溶于苯酚而RNA不溶,故可用苯酚来沉淀RNA.

6.紫外吸收：核酸的λm＝260nm,碱基展开程度越大,紫外吸收就越厉害.当A＝1时,DNA：50ug/ml,RNA和单链DNA：40ug/ml,寡核苷酸：20ug/ml.用A260/A280还可来表示核酸的纯度.

7.沉降速度：对于拓扑异构体（核苷酸数目相同的核酸）,其沉降速度从达到小依次为：RNA ; 超螺旋DNA > 解链环状DNA ; 松弛环状DNA ; 线形DNA也就是在离心管中最上层是线形DNA,最下面是RNA.

8.电泳：核苷酸、核酸均可以进行电泳,泳动速度主要由分子大小来决定,因此,电泳是测定核酸分子量的好方法.

9.DNA分子量测定最直接的方法：用适当浓度的EB（溴嘧啶）染色DNA,可以将其他形式的DNA变成线形DNA,用电镜测出其长度,按B-DNA模型算出bp数,根据核苷酸的平均分子量就可计算出DNA的分子量.

2018年医疗器械体外诊断产品分类界定结果汇总

张勇1，苏新1，陈芳2，蒋宏忱1，陆红峰2，周洋2，王媛媛1

张勇（1981－），男，博士研究生，主要从事海洋地质微生物研究。

1.中国地质大学地质微生物实验室，北京　100083

2.广州海洋地质调查局，广州　510760

摘要：利用分子生物学技术，分析南海北部神狐海域天然气水合物潜力区HS-373PC岩心表层沉积物中古菌多样性，从沉积物中提取总DNA并扩增古菌16S rRNA基因序列，对克隆文库进行系统发育分析。结果显示：所有古菌序列均属于泉古菌（Crenarchaeota）和广古菌（Euryarchaeota）。其中泉古菌以C3为主要类群，另有少量序列属于marine benthic group (MBG)-B,MBG-C、marine crenarchaeotic group I (MGI）、marine hydrothermal vent group (MHVG）和novel group of crenarchaea(NGC）；广古菌以MBG-D为主，其他序列分别属于Unclassified Euryarchaeotic Clusters-1/2 (UEC-1/2）。

关键词：古菌多样性；16S rRNA；海洋沉积物；天然气水合物调查区；神狐海域；南海北部陆坡

Archaea Diversity in Surface Marine Sediments from Shenhu Area,Northern South China Sea

Zhang Yong1,Su Xin1,Chen Fang2,Jiang Hongchen1,Lu Hongfeng2,Zhou Yang2,Wang Yuanyuan1

1.Geomicrobiology Laboratory,School of Ocean Sciences,China University of Geosciences,Beijing 100083,China

2.Guangzhou Marine Geological Survey,Guangzhou 510760,China

Abstract:Archaeal diversity in the surface sediments from Shenhu Area in South China Sea was studied with the use of 16S rRNA gene phylogenetic analysis.All the retrieved archaeal clone sequences could be grouped into Marine Benthic Group(MBG)-B,-C and-D,Novel Group of Crenarchaea,C3,Marine Hydrothermal Vent Group,Marine Crenarchaeotic Group I,and unclassified euryarhaeotic group,among which MBG-D and C3 were the most predominant groups in the Euryarchaeota and Crenarchaeota,respectively.The results indicated that archaea were abundant and diverse in surface sediments from the northern South China Sea.

Key words:archaeal diversity; 16S rRNA; marine sediments; gas hydrate exploration area; shenhu area;northern south China Sea

0 引言

海洋生态环境独特，具有高盐、高压、低温、寡营养和光照强度变化大等特点。生活在这一复杂环境中的微生物为适应独特环境条件，在物种类型、代谢类型、功能基因组成和生态功能上形成丰富的多样性[1]，其中原核微生物主要为古菌和细菌两大类群[2]。早期有关古菌存在及多样性的研究仅局限于温度、p H和盐度比较极端与厌氧的环境下，在这些极端环境中发现了超嗜热菌、极端嗜酸菌、极端嗜盐菌和产甲烷菌。目前已经从热泉、热液喷孔、硫质喷孔、盐湖、高碱湖、下水道消化池和瘤胃这些典型的环境中分离出了古菌[2]。随着分子生物学技术的发展，古菌研究的范围逐渐扩大，常见的环境比如海水[3]、盐湖水[4]和土壤[5-6]中，都发现有大量的古菌存在。随着研究领域的扩大，对古菌的分布、新陈代谢的多样性、从极端环境到普通环境的垂向变化以及在生态系统中所起作用的研究显得愈加重要。海洋深部生物圈内的古菌群落已经作为特定地质微生物标志，被用来指示过去和现代海洋的地球化学变化和地质环境的变迁[7]。

南海神狐海域天然气水合物调查研究区位于南海北部陆坡中段神狐暗沙东南海域附近，即西沙海槽与东沙群岛之间海域。根据野外地温梯度测量和室内沉积物样品的热导率测量结果以及钻探站位温度原位测量结果表明，神狐海域研究区的地温梯度为45～67.7℃/km，其热流和地温梯度处于中—低范围，该区域流体相对活跃，断层发育，有利于天然气水合物的发育[8]。2006年我国在该区实施钻探，已经成功获取了天然气水合物样品[8]。笔者对神狐海域天然气水合物调查区HS-373PC样品岩心表层5～20 cm深度沉积物开展了古菌多样性的调查，并初步探讨它们与沉积物中地质环境的相互作用。

1 材料方法

1.1 样品采集

2006年夏， “ 海洋四号”调查船在南海北部神狐海域（19°51.2803 ' N,115°12.0888 ' E）水深1 402 m处获得重力活塞岩心HS-373PC样品，岩心全长928 cm。本文通信作者随船考察，并采取微生物样。微生物取样间隔为50 cm，取样后在无菌箱中切除表面沉积物，内部样品置于无菌袋保存于液氮中，航次结束后用干冰运至实验室于－20℃保存。实验室操作时，切除表面沉积物以防止污染。

用于微生物计数的样品采集参考国际大洋钻探（ODP:ocean drilling program)201和204航次中所应用的微生物样品处理方法[9-10]，在无菌操作箱中进行：用灭菌手术刀切除岩心外部沉积物，灭菌注射器取约1 cm3样品，加入9 m L高温灭菌并过滤除菌（0.2 mm）的海水，加入终浓度为4％的甲醛固定，置于4℃保存。航次结束后低温运到实验室4℃保存。

1.2 微生物计数（acridine orange direct count,AODC）

样品细胞计数参照吖啶橙直接染色计数法[11]改进。样品漩涡震荡10 min，取1 m L加入9 m LPBS(0.145 mol/L Na Cl,0.0045 mol/L KH2PO4,0.0055 mol/L K2HPO4，灭菌）缓冲液，震荡5min,400r/min离心5 min，静置1 h充分沉淀，取上清液加入1％的吖啶橙5m L，黑暗中染色15 mm，过滤到孔径0.22μm的聚碳酸酯膜（Whatman,UK）上，用10 m L PBS缓冲液冲洗滤膜，置于载玻片上，于荧光镜下观察计数。

1.3 DNA提取与16Sr DNA的扩增

称取约1 g样品，使用Ultra Clean soil DNAkit (Mo Bio,Solana Beach,Calif.,US）试剂盒提取总DNA，溶于灭菌的纯水中。

古菌扩增引物为：Arch21F(5’－TTC YGG TTGATC CYG CCRGA-3’，Y=A,C or G;R=A or G）和Arch958R(5’－YCC GGC GTT GAM TCCATTT-3’，M=Aor C)[3]。PCR反应条件：95℃变性7min，然后94℃变性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸1.5min,45个循环，最后72℃延伸10 min。产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收。

1.4 克隆文库的构建与5序列分析

纯化回收后的PCR产物连接到p GEM-T Easy Vector(Promega,US）上，转化Escherichiacoli.JM109感受态细胞。取适量转化后培养的细胞涂到含氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB平板上， 37℃培养过夜，12～16 h后取出，置于4℃冰箱。

随机挑选部分白色转化子，接种到上述LB平板上，37℃培养后，使用引物M13-RV (5'－CAG GAA ACA GCT ATG AC-3＇）和M13-47(5'－GTT TTC CCA GTC ACG AC-3＇）做菌落PCR。反应条件如下：95℃变性10min，加入1.25U Taq酶，然后94℃变性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸2min,35个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，挑选部分样品进行测序。

所得序列用Sequencer 4.8(Gene Codes Corporation,US）软件进行分析，经Bio Edit软件编辑后，以97％的序列相似性作为划分标准[12]，使用DOTUR软件（）选出运算分类单位（operational taxonomic unit，或OTU），用a Rarefact Win软件（～strata/software.html.）得出饱和曲线。所得OTU对应序列输入NCBI数据库，在线使用BLAST (basic local alignment search tool）对比序列，采用Neighbor-Joining建树方法构建系统发育树。

本研究中所得到的古菌16Sr DNA序列在Gen Bank核酸数据库里的接受序列号为HS373A1－HS373A98(FJ896063-FJ896103); HS373A107-HS373A16(GU181294-GU181316）。

2 结果与分析

2.1 沉积物微生物计数

表层沉积物中的总微生物计数使用吖啶橙染色直接计数法，计数结果显示微生物的数量约为1.69×107cells/g沉积物（湿重）。

2.2 古菌多样性分析

所测序列经筛选后得到132个有效序列，共分为64个OTU。文库覆盖率C=1－(n/N）（其中n为OTU中只出现一个克隆子的数目，N为总序列数）为68.2％。使用a Rarefact Win软件分析得到克隆文库的饱和曲线（图1）。

图1 南海北部HS-373PC岩心表层沉积物中古菌16SrRNA基因序列饱和曲线

该132个序列均属于未培养类型，同源序列大多数来自海洋沉积物，分别属于泉古菌（Crenarchaeota）和广古菌（Euryarchaeota）两大类（图2）。其中泉古菌以C3[13]为主（占总序列的24％），其他序列属于marine benthic group (MBG)-B[14],MBG-C[15],marine crenarchaeotic group Ⅰ（MGI)[16],marine hydrothermal vent group (MHVG)[17]和novel group ofcrenarchaea(NGC)[15]。广古菌以MBG-D[13]为主（占总序列的16％），其他序列属于unclassified euryarchaeotic clusters (UEC)-1/2。各类群所占比例见图3。

泉古菌中包含92个克隆序列（占总序列的70%）。其中以C3为主要类群，包含32个克隆，同源序列来源广泛，其中大多数来自南海沉积物中，相似性在97％～99％之间。其他同源性最高的序列来自太平洋秘鲁边缘海（ODP Leg 201）和喀斯喀特边缘海（ODP Leg 204）含有水合物的沉积物[13]、墨西哥湾沉积物（AB448792）和维多利亚港沉积物（EF203609）。MBG-B（也称为Deep-Sea Archaeal Group,DSAG)[17-19]类群最先发现于深海沉积物和热液口，该类群广泛存在于多种深海环境中[20]，文库中有2个克隆属于该类群，同源序列来自鄂霍次克海冷泉沉积物[15]、墨西哥湾沉积物（IODP Site 1230）和Juan de Fuca海岭沉积物[15]，相似性为98％～99％，这几个地区沉积物均发现水合物存在。20个克隆属于MBG-C，同源序列（相似性为95％～99％）来自深海沉积物和红树林土壤。12个克隆属于MGI，同源序列源自南海沉积物[16,21]和北冰洋沉积物（FJ571813），相似性在97％～99％之间。有4个克隆属于MHVG，与来自墨西哥湾沉积物的克隆（AB432999）相似性最高（99%）。NGC类群有20个克隆，其中相似性最高（相似性98％）的序列（EU713901）来自鄂霍次克海[15]，其他克隆相似性最高的序列（DQ984855）和（AB433026）分别来自南海沉积物和墨西哥湾深海沉积物，相似性仅为89％和92％。

广古菌包含40个（占总序列的30％）克隆序列。其中MBG-D是优势类群，有21个克隆属于该类群，分为13个OTU。其中大部分克隆同源序列来源于南海[16,21]、智利瓦斯科湖、Skan湾[22]、墨西哥湾、日本南海海槽[23]、鄂霍次克海[15]和秘鲁边缘（ODP Leg 201）有机含量丰富不含水合物的深海沉积物[13]。另2个克隆相似性最高的序列（AF068817）来自大西洋中脊热压喷口[24]，同源性只有86％。19个克隆组成UEC类群，9个克隆属于UEC-1，同源序列来源于南海沉积物、Baby Bare海湾热液喷口[25]和Skan湾[22]。10个克隆属于UEC-2，相似性最高的序列来源于南海[26]和Santa Barbara海盆[27]，相似性在96％～99％之间。

3 讨论

海底沉积物表层有机质含量相对比较丰富，为微生物的生长繁殖提供充足的物质能量。据统计太平洋表层沉积物中微生物（包括细菌和古菌）丰度为108～109cells/cm3沉积物[28]，有活性的微生物丰度为108cells/cm3沉积物[29]。本文HS-373PC岩心表层沉积物使用吖啶橙染色计数获得的微生物的数量，与南海南沙盆底陆坡沉积物中使用荧光原位杂交计数的结果[16]相比数量偏低。

图2 南海北部HS-373PC岩心表层沉积物中古菌16SrRNA基因序列系统发育树

图3 南海北部HS-373PC岩心表层沉积物古菌文库中各类群所占的比例

（其中“Un”为未分类的类别）

HS-373PC岩心的表层沉积物中古菌多样性虽然比较高，但从序列类别来说，大部分所在的类群在其他海区沉积物中都有发现[13,15,17-20,22-24]。尤其是大多数序列与南海其他地区沉积物中所报道的古菌类群[16,21,26]具有很高的相似性。而且在群落组成结构等方面比较起来还是有所不同。

与南海其他地区古菌类群相比，如在西沙海槽表层沉积物中古菌以MGI为主要类群（49.2%），其他包括TMEG(terrestrial miscel1aneous euryarch-aeotic group）、MBG-A/B/D、C3和NEG(novel euryarchaeotic group）类群以及17％的UEC克隆[21]。南海琼东南沉积物中古菌以MCG和MBG-B(DSAG）为主要类群（各占27％），其他还存在MBG-D、SAGMEG、TMEG和3个克隆的甲烷八叠球菌（Methanosarcinales）以及29％的UEC克隆[26]。MGI类群常发现于海洋和陆地环境，在海洋环境中，广泛分布于表层和次表层沉积物中，该类群可能兼性自养或者代谢类型多样[30]。本文神狐海域水合物潜力区的表层沉积物中的古菌，也有MGI类群出现，该类群所占比例仅为9％。MBG-B类群最先发现于热液口深海沉积物，目前在深海海底沉积物中均发现此类群[20]，该类群在底部甲烷上涌流的上层硫酸盐还原带沉积物中含量丰富，可能在硫酸盐还原和甲烷氧化中起重要作用[31]；此类群在南海琼东南盆地表层沉积物中所占比例较高，在神狐海域表层沉积物中，只有2个克隆出现，测试表明该深度甲烷体积分数较低（约40×10-6），而硫酸根质量浓度较高（2 655 mg/L），说明该深度甲烷氧化与硫酸盐还原程度还比较低。

与上述南海所报道2个地区古菌多样性相比，神狐海域HS-373PC表层沉积物中古菌C3类群的克隆明显占优。该类群尚未有培养种类，具体代谢类型还不清楚。类群中相似性最高的序列来自太平洋秘鲁边缘（ODP Leg 201）和喀斯喀特边缘海（ODP Leg 204）含有水合物的沉积物。

西太平洋日本南海海槽含有天然气水合物的沉积物中，古菌多样性很低，只发现有3种类群的古菌类群，分别与脱硫球菌、热网菌和热球菌相似，没有发现其他类群[32]。东太平洋美国俄勒冈州外海水合物海岭的ODP 204航次1244、1245和1251站位有水合物存在的表层沉积物岩心中，古菌以MBG-B(DSAG）类群为主[13]（约占50％～100%）。而位于东太平洋赤道海域ODP 201航次几个地质环境不同钻探站位的表层沉积物中古菌群落结构不同，其中1230站位（含天然气水合物）古菌以MBG-B(DSAG）类群为主[13];1227站位（不含水合物但有机质含量丰富）古菌以MCG和SAGMEG为主要类群，不含MBG-B(DSAG）类群[13]；而1225站位（不含天然气水合物且有机含量低）古菌以MGI和MBG-A为主要类群，但含少量MBG-B(DSAG）类群[13]。由此可见，即使是在发现了天然气水合物的地区，表层样中古菌的类型和群落结构也随海域或同海域不同站位地质环境而变化。神狐海域HS-373PC表层沉积物古菌的优势类群和上述地区明显不同。前人对南海表层沉积物有机质含量的总结表明，神狐地区属于有机质含量较低的地区[33]。因此，如果就HS-373PC表层沉积物中有机质含量低而古菌群落含少量MBG-B类群这2点来看，和东太平洋赤道海域ODP 201航次1225站位具有一定的相似性。

该岩心采集的区域属于已确定的天然气水合物潜力区，一系列的数据强烈暗示该区沉积物深部存在着天然气水合物[8]。但对该岩心表层沉积物中古菌多样性分析后发现，古菌中没有明显指示天然气水合物存在的类群出现，可能是本文所取的样品处于沉积物表层，各种参数变化不明显，在古菌多样性上没有明显的显示。对于HS-373PC岩心中微生物多样性和地质环境的关系进一步的探讨，还有待于建立在未来获得更多微生物和地质环境分析的基础上。

参考文献

[1]任立成，李美英，鲍时翔.海洋古菌多样性研究进展[J].生命科学研究，2006,10(2）:67-70.

[2]Chaban B,Ng S Y,Jarrell K F.Archaeal Habitats-From the Extreme to the Ordinary[J].Canadian Journal Microbiology,2006,52:73-116.

[3]De lo ng E F.Archaea in Coastal Marine Environments[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1992,89:5685-5689.

[4]Jiang H C,Dong H L,Yu B S,et al.Dominance of Putative Marine Benthic Archaea in Qinghai Lake,Northwestern China[J].Environmental Microbiology,2008,10(9):2355-2367.

[5]Walsh D A,Papke R T,Doolittle W F.Archaeal Diversity Along a Soil Salinity Gradient Prone to Disturbance[J].Environmental Microbiology,2005,7(10):1655-1666.

[6]Yan B,Hong K,Yu Z M.Archaeal Communities in Mangrove Soil Characterized by 16S rRNA Gene Clones[J].The Journal of Microbiology,2006,43(5):566-571.

[7]Inagaki F,Takai K,Komatsu T,et al.Archaeology of Archaea:Geomicrobiological Record of Pleistocene Thermal Events Concealed in a Deep-Sea Subseafloor Environment[J]Extremophiles,2001,5(6):385-392.

[8]吴能友，张海A，杨胜雄，等.南海神狐海域天然气水合物成藏系统初探[J]天然气工业，2007,27(9）:1-6.

[9]Shipboard Scientific Party.Explanatory Notes[C]//D'Hondt S,Jogensen B B,Miller D J,et al.Proceedings of the Ocean Drilling Program,Intial Reports.Texas:College Station,2003,201:1-103.

[10]Shipboard Scientific Party.Explanatory Notes[C]//Trehu A M,Bohrmann G,Rack F,et al.Proceedings of the Ocean Drilling Program,Intial Reports.Texas:Texas A&M University,2003,204:1-102.

[11]Bottomley P J.Light Microscopic Methods for Studying Soil Microorganisms[C]//Weaver R.Methods of Soil Analysis,Part 2.Microbiological and Biochemical Properties.SSSA Book Series no.5.Soil Science Society of America,Madison,Wis.1994:81-105.

[12]Humayoun S B,Bano N,Hollibaugh J T.Depth Distribution of Microbial Diversity in Mona Lake,Amermictic Soda Lake in California[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69:1030-1042.

[13]Inagaki,F,Nunoura T,Nakagawa S,et al.Biogeographical Distribution and Diversity of Microbes in Methane Hydrate Bearing Deep Marine Sediments on the Pacific Ocean Margin[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2006,103:2815-2820.

[14]Mason O U,Di Meo-Savoie C,Van Nostrand J D,et al.Prokaryotic Diversity,Distribution,and Insights Into Their Role in Biogeochemical Cycling in Marine Basalts[J].The ISME Journal,2009,3(2):231-242.

[15]Dang H Y,Luan X,Zhao J,et al.Diverse and Novel Nif H and NifH-Like Gene Sequences in the Deep-Sea Methane Seep Sediments of the Okhotsk Sea[J].Applied and Environmental Microbiology,2009,75(7):2238-2245.

[16]李涛，王鹏，汪品先.南海南部陆坡表层沉积物细菌和古菌多样性[J].微生物学报，2008,48(3）:323-329.

[17]Inagaki F,Suzuki M,Taikai K,et al.Microbial Communities Associated with Geological Horizons in Coastal Subseafloor Sediments from the Sea of Okhotsk[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(12):7224-7235.

[18]Vetriani C,Jannasch H H,Mac Gregor B J,et al.Population Structure and Phylogenetic Characterization of Mari ne Benthic Archaea in Deep-sea Sediments[J].Applied and Environmental Microbiology,1999,65(10):4375-4384.

[19]Takai K ,Horikoshi K.Genetic Diversity of Archaea in Deep-Sea Hydrothermal Vent Environments[J].Genetics,1999,152:1285-1297.

[20]Sorensen K,Teske A.Stratified Communities of Active Archaea in Deep Marine Subsurface Sediments[J].Applied and Environmental Microbiology,2006,72(7):4596-4603.

[21]李涛，王鹏，汪品先.南海西沙海槽表层沉积物微生物多样性[J]生态学报，2008,28(3）:1166-1173.

[22]Kendall M M,Wardlaw G D,Tang C F,et al.Diversity of Archaea in Marine Sediments from Skan Bay,Alaska,Including Cultivated Methanogens,and Description of Methanogenium Boonei sp.Nov[J].Applied and Environmental Microbiology,2007,73(2):407-414.

[23]Nunoura T,Oida H,Toki T,et al.Quantification of Mcr A by Quantitative Fluorescent PCR in Sediments from Methane Seep of the Nankai Trough[J].FEMS Microbiology Ecology,2006,57(1）:149-157.

[24]Reysenbach A L,Longnecker K,Kirshtein J.Novel Bacterial and Archaeal Lineages from an in Situ Growth Chamber Deployed at a Mid-Atlantic Ridge Hydrothermal Vent[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66(9):3798-3806.

[25]Huber J A,Hohnson H P,Butterfield D A,et al.Microbial Life in Ridge Flank Cru stal Fluids[J].Environmental Microbiology,2006,8(1):88-99.

[26]Jiang H C,Dong H L,Ji S,et al.Microbial Diversity in the Deep Marine Sediments from the Qiongdongnan Basin in South China Sea[J].Geomicrobiology Journal,2007,24:505-517.

[27]Harrison B K,Zhang H,Berelson W,et al.Variations in Archaeal and Bacterial Diversity Associated with the SulfateMethane Transition Zone in Continental Margin Sediments (Santa Barbara Basin,California)[J].Applied and Environmental Microbiology,2009,75(6):1487-1499.

[28]Parkes R J,Cragg B A,Bale S J,et al.Deep Bacterial Biosphere in Pacific Ocean Sediments[J].Nature,1994,371:410-413.

[29]Schippers A,Neretin L N,Kallmeyer,J,et al.Prokaryotic Cell of the Deep Sub-Seafloor Biosphere Identified as Living Bacteria[J].Nature,2005,433:861-864.

[30]Teske A.Microbial Community Composition in Deep Marine Subsurface Sediments of ODP Leg 201:Sequencing Surveys and Cultivations[C]//Jorgensen B B,D'Hondt S,Miller D J.Proceedings of the Ocean Drilling Program,Scientific Results 2006,201,1-19.

[31]Biddle J F,Lipp J S,Leverd M A,et al.Heterotrophic Archaea Dominate Sedimentary Subsurface Ecosystems off Peru.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2006,103(10):3846-3851.

[32]Reed D W,Fujita Y,Delwiche M E,et al.Microbial Communities from Methane Hydrate-Bearing Deep Marine Sediments in a Forearc Basin[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68(8):3759-3770.

[33]苏新，陈芳，于兴河，等.南海陆坡中世纪以来沉积物特性与气体水合物分布初探[J].现代地质，2005,19(1）:1-13.

近日，中检院发布《2018年医疗器械产品分类界定结果汇总》，其中涉及573个产品共分七大类：

一、按照III类医疗器械管理的产品（69个）；

二、按照II类医疗器械管理的产品（122个）；

三、按照I类医疗器械管理的产品（219个）；

四、不单独作为医疗器械管理的产品（19个）；

五、按药械组合管理的产品（22个）；

六、不作为医疗器械管理的产品（110个）；

七、视具体情况而定的产品（12个）。

说明：

1.产品分类界定结果是基于申请人提供的资料得出，不代表对其产品安全性和有效性的认可，仅作为医疗器械产品注册和备案的参考；结果中产品描述和预期用途是用于判定产品的管理属性和类别，不代表相关产品注册或备案内容的完整表述。

2.?《医疗器械分类目录》中暂无对应一级产品类别的“分类编码”以“00”表示，如“等离子体治疗仪”的分类编码：09-00。

涉及到体外诊断产品如下：

一、按照III类医疗器械管理的产品（34个）

1.即时真空自动采血仪：由移动换管单元、刺塞混匀单元、送针单元、抽真空单元、采血管排架、光学定量检测单元、电子控制单元和溢血检测单元组成。通过机器内负压泵产生的负压对人体进行采血，依靠光学检测系统对采血量进行定量检测，采血后立即旋转采血管将血液与管内添加剂混合均匀，最终得到符合要求的血液样本。临床上用于医院门诊和采血中心采集患者静脉血使用。分类编码：22-11。

2.基因测序用文库试剂盒：由文库扩增反应液、缓冲液、DNA连接酶和序列接头组成。用于处理从外周全血或石蜡包埋组织中提取的人类基因组DNA以及由此产生的样本库的目标序列。与Illumina二代测序仪及测序反应通用试剂盒配合使用。不用于人全基因组测序或从头测序。分类编码：6840。

3.泛素羧基末端水解酶-1（UCH-L1）测定试剂盒（磁微粒化学发光法）：由泛素羧基末端水解酶-1（UCH-L1）检测试剂条、质控品、校准品、干燥剂组成。用于人血清样本中UCH-L1含量的测定，临床上可用于监测神经退行性疾病肿瘤发生发展过程、脑外伤的辅助诊断等。分类编码：6840。

4.阴道滴虫（T.V）分泌蛋白检测试剂盒（胶体金法）：由阴道滴虫（T.V）分泌蛋白检测试纸条/试纸卡和样品缓冲液组成。用于定性检测女性阴道分泌物、尿液样本中的阴道滴虫分泌性蛋白，临床上用于女性阴道炎滴虫感染的辅助诊断。分类编码：6840。

5.念珠球菌（C.Alb）分泌蛋白检测试剂盒（胶体金法：由念珠球菌（C.Alb）分泌蛋白检测试纸条/试纸卡和样品缓冲液组成。用于定性检测女性阴道分泌物样品和尿液样品中的念珠球菌分泌性蛋白，临床上用于女性念珠球菌阴道炎感染的辅助诊断。分类编码：6840。

6.幽门螺旋杆菌（H.P）分泌蛋白检测试剂盒（胶体金法）：由幽门螺旋杆菌（H.P）分泌蛋白检测试纸条/试纸卡和样品缓冲液组成。用于定性检测粪便样品中的幽门螺旋杆菌分泌性蛋白，临床上用于胃炎、消化道溃疡、十二指肠溃疡等炎症的辅助诊断。分类编码：6840。

7.结核菌（TB）分泌蛋白检测试剂盒（胶体金法）：由结核菌（TB）分泌蛋白检测试纸条/试纸卡和样品缓冲液组成。用于定性检测结核菌培养基、痰液中的结核菌分泌性蛋白，临床上用于结核病的辅助诊断。分类编码：6840。

8.人外周血白细胞去除试剂盒（阴性免疫磁微粒法）：由血液前处理液A、血液前处理液B、分离溶液和磁微粒混悬液组成。用于体外去除全血中的白细胞，以用于下游多种分析。分类编码：6840。

9.IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α测定试剂盒（流式细胞仪法）：由捕获微球混合液、定量标准品、荧光检测试剂、校准微球、校准液A、校准液B、样品稀释液、微球缓冲液组成。用于检测血清或血浆中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α蛋白的含量。临床上用于疾病的辅助诊断、用药及预后干预。分类编码：6840。

10.IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ测定试剂盒（流式细胞仪法）：由捕获微球混合液、定量标准品、荧光检测试剂、校准微球、校准液A、校准液B、样品稀释液、微球缓冲液组成。用于检测血清或血浆中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ蛋白的含量。临床上用于疾病的辅助诊断、用药及预后干预。分类编码：6840。

11.HER2三合一病理质控片：由3株不同来源的经福尔马林固定、石蜡包埋的人乳腺癌细胞系样本组成。在特定的检测系统上，该质控片与HER2 DNA探针以及17号染色体探针一起使用，用于半定量监测原位杂交（ISH）的探针性能。分类编码：6840。

12.HER-2四合一病理质控片：由4株不同来源的经福尔马林固定、石蜡包埋的人乳腺癌细胞株组成。用于监测抗-c-erbB-2/HER-2抗体的免疫组化染色性能。分类编码：6840。

13.HER2双染原位杂交三合一病理质控片：由3株不同来源的经过福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤细胞系组成。在专用的检测系统上，与特定探针一起使用，用于临床检测实验的质量控制。分类编码：6840。

14.二硝基苯（DNP）抗体试剂：由二硝基苯（DNP）兔单克隆抗体、含载体蛋白和防腐剂的缓冲液组成。临床上，与HER2/CEN17双探针检测试剂盒配合使用，用于检测DNP标记的HER2 DNA探针和17号染色体探针。分类编码：6840。

15.趋化因子五联检测试剂盒（流式细胞仪法）：由捕获微球混合液（聚苯乙烯、抗人CXCL8/IL-8单抗、抗人CCL5/RANTES单抗、抗人CXCL9/MIG单抗、抗人CCL2/MCP-1单抗、抗人CXCL10/IP-10单抗）、定量标准品（人体重组蛋白冻干粉）、荧光检测试剂（PE标记的微球检测抗体）、校准微球（聚苯乙烯磁性粒子微球）、校准液A（藻红蛋白荧光素标记的对照抗体）、校准液B（异硫氰酸荧光素标记的对照抗体）、样品稀释液（缓冲液、氯化钠、胎牛血清、防腐剂）组成。与流式细胞仪配合使用，用于样本中5种趋化因子（CXCL8/IL-8、CCL5/RANTES、CXCL9/MIG、CCL2/MCP-1、CXCL10/IP-10）含量的检测。临床上用于评估机体免疫功能。分类编码：6840。

16.基因测序文库试剂盒（转座酶法）：由试剂1（片段化缓冲液、片段化酶、扩增缓冲液、扩增酶、洗脱液）、试剂2（标签引物）、试剂3（磁珠）组成。与基因测序的通用试剂结合Illumina基因测序系统一起使用，用于处理人类基因组DNA、单细胞扩增产物、cDNA并进行文库构建。分类编码：6840。

17.基因测序用测序试剂盒：由dNTP、反应酶、测序引物、缓冲液等组成。与基因测序用文库试剂盒、基因测序用模板试剂盒及基因测序用芯片结合Ion torrent测序平台一起使用，用于处理从组织样本中提取的人类基因组DNA以及由此产生的样本库的目标序列。不用于人全基因组或从头测序。分类编码：6840。

18.AML/MDS探针芯片（原位杂交法）：由AML/MDS探针芯片、样本片、芯片杂交缓冲液组成。通过一次杂交试验，定性检测样本中P53、PML/RARA、KMT2A、AML1/ETO、5q31（EGR1/TERT）、CBFB/MYH11、7q31(D7S486/CSP7)和D20S108/CSP8基因是否存在异常。临床上用于白血病的辅助诊断。分类编码：6840。

19.ALL探针芯片（原位杂交法）：由ALL探针芯片、样本片、芯片杂交缓冲液组成。通过一次杂交试验，定性检测样本中MYC、ETV6/AML1、IGH、BCR/ABL1（DF）、E2A、CDKN2A/CSP17、KMT2A、4/10基因是否存在异常。临床上用于指导酪氨酸激酶抑制剂用药。分类编码：6840。

20.MPN探针芯片（原位杂交法）：由MPN探针芯片、样本片、芯片杂交缓冲液组成。通过一次杂交试验，定性检测样本中FGFR1、PDGFRB、PDGFRA、BCR/ABL1（DF）基因是否存在异常情况。临床上用于指导酪氨酸激酶抑制剂用药。分类编码：6840。

21.ph-like ALL探针芯片（原位杂交法）：由ph-like ALL探针芯片、样本片、芯片杂交缓冲液组成。通过一次杂交试验，定性检测样本中CRLF2、PDGFRB、ABL1、CSF1R、BCR/ABL1（DF）、ABL2、JAK2、EPOR基因是否存在异常。临床用于Ph样急性淋巴细胞白血病的辅助诊断。分类编码：6840。

22.全自动血库系统：由加样器、传送装置、打孔机构、孵育器、离心机、判读仪、条码扫描装置、电脑控制软件组成。临床上用于检测本公司生产的ABO、RhD血型抗原检测卡，ABO、Rh（D）血型定型检测卡，ABO、Rh血型抗原检测卡及抗人球蛋白检测卡。实现自动化样本分配、试剂分配、孵育、离心、结果判读（阴性、阳性）及储存。分类编码：22-01。

23.中性检测卡（微柱凝胶法）：主要由8个微孔管、右旋糖苷聚体与防腐剂等组成。通过抗原、抗体反应和分子筛作用，实现凝集红细胞与未凝集红细胞的分离。临床上用于检测红细胞的凝集反应。分类编码：6840。

24.基因测序用文库试剂盒（DNA打断连接法）：由末端修复混合液、末端修复缓冲液、T4 DNA连接酶、T4 DNA连接缓冲液、PCR混合液、适用于Illumina测序平台的接头、通用引物和序列标签引物1-12组成。用于Illumina二代测序平台的DNA测序文库的构建。分类编码：6840。

25.测序用文库制备试剂盒：主要由片段捕获反应液、引物消化酶、连接缓冲液、DNA连接酶、文库扩增反应液、扩增PCR引物、洗脱液、特异性接头混合液1-96、DNA纯化磁珠等组成。通过多重PCR技术进行目的基因扩增，再使用引物消化酶对扩增产物进行切割，形成可以连接特异接头混合液的平末端，在连接缓冲液和DNA连接酶的作用下形成可用于Ion torrent测序平台的文库。分类编码：6840。

26.表皮生长因子受体v Ⅲ（EGFR v Ⅲ）抗体试剂（免疫组织化学法）：由表皮生长因子受体v Ⅲ（EGFR v Ⅲ）抗体、缓冲液组成。可用于体外定性检测经10%中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋人体组织中的EGFR v Ⅲ蛋白，临床上用于多种肿瘤（如乳腺癌、肝癌、结肠癌）的新型诊断和治疗靶点。分类编码：6840。

27.酪氨酸激酶受体（ROS1）抗体试剂（免疫组织化学法）：由酪氨酸激酶受体（ROS1）抗体试剂组成。临床上具有非小细胞肺癌的诊断价值或用于ROS1基因重排肺癌的筛查。分类编码：6840。

28.结核分枝杆菌分泌蛋白（Ag85B）（免疫组织化学法）：由结核分枝杆菌分泌蛋白（Ag85B）抗体试剂组成。在常规染色基础上进行免疫组织化学染色，临床上具有结核病病理诊断价值。分类编码：6840。

29.表皮生长因子受体L858R（EGFR L858R）突变蛋白抗体试剂（免疫组织化学法）：由表皮生长因子受体L858R突变蛋白（EGFR L858R）抗体、缓冲液组成。可用于体外定性检测经10%中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋人体组织中的EGFR L858R蛋白，临床上具有非小细胞肺癌的诊断价值。分类编码：6840。

30.MDS探针芯片（原位杂交法）：由MDS探针芯片、样本片、芯片杂交缓冲液组成。通过一次杂交试验，定性检测样本中5q33(CSF1R/TERT)、D20S108、5q31（EGR1/TERT）、X/Y、7q31（D7S522/CSP7）、7q31（D7S486/CSP7）基因是否存在异常。临床上用于骨髓增生异常综合征的辅助诊断。分类编码：6840。

31.IFN-γ/IL-4检测试剂（流式细胞仪法）：由磷酸盐缓冲液（PBS）、荧光FITC/PE标记的IFN-γ/IL-4单克隆抗体组成。通过流式细胞法检测人体生物标本中IFN-γ和IL-4，临床上用于慢性淋巴细胞白血病(CLL)，感染性疾病的辅助诊断。分类编码：6840。

32.文库构建与纯化试剂盒：由T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、T4连接酶缓冲液、腺嘌呤核苷三磷酸、聚乙二醇4000、聚乙二醇8000、氯化钠脱氧核糖核苷三磷酸、去离子水、PCR引物、高保真PCR酶、羧基磁珠组成。用于Illumina二代测序文库构建以及纯化等步骤。分类编码：6840。

33.文库制备试剂盒：由缓冲液1、反应酶1、缓冲液2、反应酶2、接头标签、PCR扩增混合液、PCR引物混合液和说明书组成。用于Illumina 测序平台的DNA测序文库的构建。分类编码：6840。

34.基因测序用文库试剂盒：由PCR混合液、适用于Illumina测序平台的通用引物和序列标签引物1-12组成。通过一步PCR扩增，获得用于Illumina二代测序平台DNA文库构建并可根据扩增引物中的Index序列获取样本测序信息。不适用于人全基因组测序。分类编码：6840。

二、按照II类医疗器械管理的产品（22个）

1.微量元素分析仪：由主机和软件组成。利用分光光度法，通过测量手掌上的测量点，获得皮肤内矿物质和重金属含量。用于检测人体皮肤内的矿物质和重金属含量，辅助筛查人体内重金属中毒或矿物质失衡引起的疾病。分类编码：07-00。

2.胶质纤维酸性蛋白（GFAP）测定试剂盒（磁微粒化学发光法）：由胶质纤维酸性蛋白检测试剂条（含抗体试剂、酶标试剂、磁分离试剂、底物液、洗液）、质控品、校准品、干燥剂、说明书组成。用于体外定量检测人血清样本中胶质纤维酸性蛋白的含量。临床上主要用于脑外伤的辅助诊断。分类编码：6840。

3.人14-3-3 eta蛋白测定试剂盒（光激化学发光法）：由试剂1（抗14-3-3 eta蛋白抗体包被的发光微粒）、试剂2（生物素标记的抗14-3-3 eta蛋白抗体）、校准品（重组抗原14-3-3 eta蛋白）、低水平质控品、高水平质控品组成。用于LiCA 500系列自动光激化学发光分析系统，对人血清中14-3-3 eta蛋白进行定量测定。临床上用于类风湿关节炎的辅助诊断。分类编码：6840。

4.紫杉醇测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）：由试剂1（紫杉醇共轭药物）、试剂2（紫杉醇抗体修饰颗粒）组成。用于定量检测人血浆样本中紫杉醇药物浓度。临床上可结合其他临床信息用于调整药物的使用剂量，提高疗效和减少不良反应。分类编码：6840。

5.伊马替尼测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）：由试剂1（磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液）、试剂2（伊马替尼抗体修饰颗粒）、校准品、质控品组成。用于定量检测人血浆样本中伊马替尼药物浓度。临床上结合其他临床信息用于及时调整用药剂量，提高化疗效果和减少不良反应。分类编码：6840。

6.5-氟尿嘧啶测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）：由试剂1（5-氟尿嘧啶共轭药物）、试剂2（5-氟尿嘧啶抗体修饰颗粒）组成。用于定量检测人血浆样本中5-氟尿嘧啶药物浓度。临床上结合其他临床信息，可为医师提供剂量管理的辅助作用。分类编码：6840。

7.多西紫杉醇测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）：由试剂1（多西紫杉醇共轭药物）、试剂2（多西紫杉醇抗体修饰颗粒）组成。用于对人血浆样本中多西紫杉醇（DTX）药物浓度的体外定量检测，临床上结合其他临床信息来进行剂量管理，提高疗效和减少不良反应。分类编码：6840。

8.可溶性CD14亚型测定试剂盒（化学发光免疫法）：由碱性磷酸酶标记的抗可溶性CD14亚型多克隆抗体、包被了抗可溶性CD14亚型单克隆抗体的磁性粒子、化学发光底物、样本稀释缓冲液、样本洗涤缓冲液组成。用于体外定量检测人全血或血浆中可溶性CD14亚型的浓度。临床上用于脓毒症的诊断及预后评估和监测疾病的过程以及对脓毒症治疗干预措施的反应。分类编码：6840。

9.人去唾液酸糖蛋白受体H2亚基（sH2a）定量检测试剂盒（酶联免疫吸附法）：由反应板、酶标抗体、标准品、稀释液、TMB底物溶液A、TMB底物溶液B、终止液和质控品组成。用于人血清样本中可溶形式的去唾液酸糖蛋白受体H2亚基（sH2a）的定量检测。临床上用于脂肪肝、酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化等肝损伤疾病的辅助诊断。分类编码：6840。

10.抗体IgG检测专用质控：由包被有质控抗原的质控膜条、检验对照、靶值参照表组成。用于免疫印迹法和欧蒙印迹法检测系统体外检测的质量控制。分类编码：6840。

11.兔单克隆阴性质控抗体：由兔单克隆抗体组成。用于福尔马林固定石蜡包埋组织切片内兔免疫球蛋白非特异性结合的质控。分类编码：6840。

12.细胞葡萄糖代谢检测试剂盒：由荧光染料Ⅰ、荧光染料Ⅱ、荧光染料Ⅲ、培养基、缓冲液、裂解液组成。用于体液样本中有核细胞的培养，以区分细胞有氧糖酵解水平高低。临床上用于炎症、免疫性疾病的辅助诊断。分类编码：6840。

13.子痫前期检测试剂盒（斑点扩散法）：主要由检测卡、染色结果示例、滴管、尿杯组成。患有子痫前期的孕妇尿液中存在错误折叠蛋白，错误折叠蛋白可与染色液特异性结合，在纤维素膜上呈现出显著的不同于正常蛋白的扩散方式。临床上通过定性检测孕妇尿液中的错误折叠蛋白来辅助诊断子痫前期。分类编码：6840。

14.帕利哌酮检测试剂盒（胶乳免疫比浊法）：由试剂1（R1：帕利哌酮共轭药物）、试剂2（R2：帕利哌酮抗体修饰颗粒）、校准品、质控品组成。临床上通过测定人血清样本中帕利哌酮的浓度控制患者的用药剂量。分类编码：6840。

15.利培酮检测试剂盒（胶乳免疫比浊法）：由试剂1（R1：利培酮共轭药物）、试剂2（R2：利培酮抗体修饰颗粒）、校准品、质控品组成。临床上通过测定人血浆样本中利培酮浓度控制患者的用药剂量。分类编码：6840。

16.伊马替尼血药浓度测定试剂盒（液相色谱-串联质谱法）：由校准品、质控品、内标等组成。通过液相色谱-串联质谱法，体外定量检测人指尖外周血采集卡干血斑中伊马替尼的浓度，临床上为医生控制患者用药剂量提供参考。分类编码：6840。

17.尿酸代谢物检测试剂盒(比色法)：由缓冲液、酶物、针探（显色液）、标准物质组成。通过对人体尿液的检测定性检测人体尿酸(次黄嘌呤,黄嘌呤)衍生物代谢是否正常，临床上用于代谢综合征的辅助诊断。分类编码：6840。

18.嗜酸性粒细胞阳离子蛋白酶标特异性抗体：主要由?-半乳糖苷酶-抗IgE (小鼠单克隆抗体)、叠氮化钠组成。与嗜酸性粒细胞阳离子蛋白检测试剂（荧光免疫法）配套使用，临床上通过体外定量检测人血清中的嗜酸性粒细胞阳离子蛋白，用于辅助诊断嗜酸性粒细胞介导的炎症性疾病，如哮喘。分类编码：6840。

19.胰弹性蛋白酶1（E1）检测试剂盒（酶联免疫法）：由酶标板、样本/洗涤缓冲液、标准液1-4、对照液1、对照液2、生物素-抗生蛋白链菌素-过氧化物酶（POD）标记的抗E1单克隆抗体、底物液、终止液组成。通过酶联免疫方法定量测定人粪便样本中E1。临床上用于诊断或排除与胃肠病状相关的胰腺疾病。分类编码：6840。

20.胍基乙酸和肌酸测定试剂盒（串联质谱法）：由内标品、高水平质控品、低水平质控品、质控品质量分析报告、内标品质量分析报告组成。通过串联质谱（MS/MS）技术，测定滤纸干血片中胍基乙酸（guanidineacetic acid，GAA）和肌酸（creatine，CRE）的浓度，适用于0-15岁（包括新生儿）及大于15岁人群的胍基乙酸和肌酸水平异常检测，临床上用于胍基乙酸甲基转移酶缺陷的辅助诊断。分类编码：6840。

21.葡萄糖校准液：由葡萄糖、杀菌剂、稳定剂、磷酸盐稀释剂组成。配合葡萄糖检测仪使用，主要用于生物传感器类葡萄糖检测仪的校准。分类编码：6840。

22.精子染色质结构检测试剂盒：由A试剂（盐酸、Tween-20、PBS）、B试剂（吖啶橙、水）组成。用于人体精子染色质的染色，判断染色质DNA断裂水平和计算发生DNA断裂的精子比例，同时还可通过染色质与蛋白结合的程度分析未成熟精子的比例。分类编码：6840。