吖啶橙荧光染色法原理-吖啶橙荧光染料进行细胞染色,可否鉴定其活

细胞内溶酶体和线粒体的荧光活体染色

Lyso-Tracker Red是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(Neutral?Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。

Mito-Tracker Green是一种线粒体(mitochondria)绿色荧光探针，可以用于活细胞线粒体特异性荧光染色。?Mito-Tracker?Green为采用Molecular?Probes公司的carbocyanine进行了荧光标记的一种Mito-Tracker，分子量为671.88，可以用作线粒体特异性的荧光探针。和rhodamine?123或JC-1相比，Mito-Tracker Green对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位。

Lyso-Tracker Red工作液的配制：

a. 取少量Lyso-Tracker Red按照1:13333-1:20000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中，使最终浓度为50-75nM。例如取1μl Lyso-Tracker Red加入到20ml13.33ml细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中。

2. 溶酶体的荧光标记：

a. 去除细胞培养液，加入步骤1配制好的并28℃预温育的Lyso-Tracker Red染色工作液，与细胞28℃共孵育30分钟。

b. 去除Lyso-Tracker Red染色工作液，加入新鲜的细胞培养液。

c. 随后通常用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到溶酶体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Lyso-Tracker Red染色工作液中Lyso-Tracker Red的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。

2. Mito-Tracker Green工作液的配制：

a. 取少量1mM Mito-Tracker Green储存液按照1:5000-1:50000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中，使最终浓度为20-200nM。例如取1μl Mito-Tracker Green加入到50ml或5ml细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中。混匀后即为Mito-Tracker Green工作液。HBSS with Ca2+ & Mg2+ (C0219) 可以向碧云天订购。

b. Mito-Tracker Green工作液使用前需28℃预温育。

注：工作液中Mito-Tracker Green的浓度可以根据实际情况进行适当调整。为降低背景，在染色效果可以接受的范围内，建议尽量使用较低浓度的Mito-Tracker Green。

3. 线粒体的荧光标记：

a. 去除细胞培养液，加入步骤2配制好的并28℃预温育的Mito-Tracker Green染色工作液，与细胞28℃共孵育15-45分钟。

b. 去除Mito-Tracker Green染色工作液，加入28℃预温育的新鲜细胞培养液。

c. 随后通常用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到线粒体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Mito-Tracker Green染色工作液中Mito-Tracker Green的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。

实验室中常用的DNA分子量的测定方法有哪些

电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂：

1、溴化乙锭（ethidium bromide, EB）

最常用的核酸荧光染料，可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。 EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶 浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这 样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。

在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了 核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光 易分解，应于4℃避光保存，

2、吖啶橙（acridine orange, AO）：

吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发 下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在 22℃，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。

3、银（Ag+）试剂：

Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及 RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的 RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA 片段回收的制备。

4、亚甲蓝（methylene blue）

可将RNA染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长。染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用净水洗5~8h（反复换水），带型肉眼可见，最低检测量为 250ng。

医学遗传学中Q显带,G显带和R显带的染色部位

第一种方法最常用

1）紫外吸收法也就是测量OD（260）和OD（280）的吸收值,这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点,因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收.

（2）荧光法,用PicoGreen荧光染料,测定DNA,RNA浓度比较灵敏,并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA,并且受其它杂质的影响不大,缺点要有专门的荧光检测仪器,试剂比较昂贵.

纯化DNA可以买试剂盒,主要有膜吸附法,磁珠分离法,都很方便.

RNA与DNA最重要的区别一是RNA只有一条链,二是它的碱基组成与DNA的不同,RNA没有碱基T（胸腺嘧啶）,而有碱基U（尿嘧啶）.所以导致他们有以下性质上的不同.

1.两性解离：DNA无,只有酸解离,碱基被屏蔽（在分子内部形成了H键）.RNA有,有PI.

2.粘度大：DNA;RNA,粘度由分子长度/直径决定,DNA为线状分子,RNA为线团.

3.碱的作用：DNA耐碱RNA易被碱水解.

4.显色反应：

鉴别DNA和RNA+浓HCl RNA ------→ 绿色化合物

DNA ------→ 蓝紫色化合物苔黑酚

二苯胺啡啶溴红（荧光染料）和溴嘧啶都可对DNA染色,原理是卡在分子中,DNA的离心和电泳显色可用它们.

DNA和RNA的鉴别染色

利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA.吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定,非固定细胞核酸,或作溶酶体的一种标记.观察亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体.虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果,但该方法已被许多实验室广泛采用.

5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇,因此,常用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA.DNA溶于苯酚而RNA不溶,故可用苯酚来沉淀RNA.

6.紫外吸收：核酸的λm＝260nm,碱基展开程度越大,紫外吸收就越厉害.当A＝1时,DNA：50ug/ml,RNA和单链DNA：40ug/ml,寡核苷酸：20ug/ml.用A260/A280还可来表示核酸的纯度.

7.沉降速度：对于拓扑异构体（核苷酸数目相同的核酸）,其沉降速度从达到小依次为：RNA ; 超螺旋DNA > 解链环状DNA ; 松弛环状DNA ; 线形DNA也就是在离心管中最上层是线形DNA,最下面是RNA.

8.电泳：核苷酸、核酸均可以进行电泳,泳动速度主要由分子大小来决定,因此,电泳是测定核酸分子量的好方法.

9.DNA分子量测定最直接的方法：用适当浓度的EB（溴嘧啶）染色DNA,可以将其他形式的DNA变成线形DNA,用电镜测出其长度,按B-DNA模型算出bp数,根据核苷酸的平均分子量就可计算出DNA的分子量.

吖啶橙的主要用途

染色体显带技术：Q带、G带、R带、C带、T带、N带，各带的染色试剂以及在染色体上所呈现的区带特征如下：

Q带：喹吖因荧光染色技术，显示中期染色体经氮芥因喹吖染色以后，在紫外线照射下所呈现的亮带和暗带，一般富含AT碱基的DNA区段表现为亮带，富含GC碱基的区带表现为暗带。

G带：Giemsa带，将中期染色体制片经胰酶或碱、尿素、去污剂等处理后再用Giemsa进行染色后所呈现的染色体区带，一般与Q带相符；

R带：中期染色体经磷酸盐缓冲液保湿处理，以吖啶橙或Giemsa染色，显示与G带明暗相间带型正好相反，所以又称反带；

C带：主要显示丝粒结构异染色质以及其它染色体区段的异染色质部分

T带：又称末端带，是染色体端粒部分经吖啶橙染色后所呈现的区带

N带：又称Ag-As染色法，主要用于核仁组织区的酸性蛋白质染色

用作荧光指示剂，肿瘤细胞及细菌、核酸染色剂及移码突变的诱变剂。

吖啶橙是一种荧光色素，吖啶橙激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。吖啶橙与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。