吖啶橙荧光染色失败原因-用丫啶橙荧光染料进行细胞染色,可否鉴定其活

荧光显微镜下观察：凋亡细胞体积缩小，呈现核固缩，沿核膜呈点状、新月状或杆状，镜下可见四种细胞形态：活细胞，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞，核染色质着绿色但呈固缩状；非凋亡的亡细胞，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞，核染色质着橘红色但呈固缩状。因为有早期凋亡（绿色）和晚期凋亡细胞（橘红色）！

DAPI、吖啶橙或其他荧光染色剂，有致癌性。染生物材料时，该做哪些防护措施呢？

吖啶橙本身就是单一的分子，你说的是吖啶橙细胞染色的方法吧：

1．PBS洗盖玻片3次。

2.　再在冷的Carnoy's中固定10min

3．用Mcllvaine's　洗3次，每次5min

4．用Mcllvaine's将1％吖啶橙稀释为1:100

5．用0．01％吖啶橙染色盖玻片5min

6．在缓冲液中冲洗盖玻片5min

7．将盖玻片用缓冲液封固于载玻片上

8．用低倍和高倍物镜在荧光镜下观察。

荧光显微镜下观察细胞，用什么染色方法？ 具体染色步骤是什么？ 有没有PA染色？ 谢谢！

手套肯定要戴，一般都是丁腈手套或者乳胶手套。一次性PE手套容易破损，不保险。

口罩一般不需要，除非是挥发性的试剂，那么建议在通风橱中操作。

废液不能随意排放，有相应的处理规范

游离的叶绿体和细胞内的叶绿体在荧光显微镜下亮度和颜色有什么区别

细胞内溶酶体和线粒体的荧光活体染色

Lyso-Tracker Red是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(Neutral?Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。

Mito-Tracker Green是一种线粒体(mitochondria)绿色荧光探针，可以用于活细胞线粒体特异性荧光染色。?Mito-Tracker?Green为采用Molecular?Probes公司的carbocyanine进行了荧光标记的一种Mito-Tracker，分子量为671.88，可以用作线粒体特异性的荧光探针。和rhodamine?123或JC-1相比，Mito-Tracker Green对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位。

Lyso-Tracker Red工作液的配制：

a. 取少量Lyso-Tracker Red按照1:13333-1:20000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中，使最终浓度为50-75nM。例如取1μl Lyso-Tracker Red加入到20ml13.33ml细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中。

2. 溶酶体的荧光标记：

a. 去除细胞培养液，加入步骤1配制好的并28℃预温育的Lyso-Tracker Red染色工作液，与细胞28℃共孵育30分钟。

b. 去除Lyso-Tracker Red染色工作液，加入新鲜的细胞培养液。

c. 随后通常用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到溶酶体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Lyso-Tracker Red染色工作液中Lyso-Tracker Red的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。

2. Mito-Tracker Green工作液的配制：

a. 取少量1mM Mito-Tracker Green储存液按照1:5000-1:50000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中，使最终浓度为20-200nM。例如取1μl Mito-Tracker Green加入到50ml或5ml细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中。混匀后即为Mito-Tracker Green工作液。HBSS with Ca2+ & Mg2+ (C0219) 可以向碧云天订购。

b. Mito-Tracker Green工作液使用前需28℃预温育。

注：工作液中Mito-Tracker Green的浓度可以根据实际情况进行适当调整。为降低背景，在染色效果可以接受的范围内，建议尽量使用较低浓度的Mito-Tracker Green。

3. 线粒体的荧光标记：

a. 去除细胞培养液，加入步骤2配制好的并28℃预温育的Mito-Tracker Green染色工作液，与细胞28℃共孵育15-45分钟。

b. 去除Mito-Tracker Green染色工作液，加入28℃预温育的新鲜细胞培养液。

c. 随后通常用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到线粒体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Mito-Tracker Green染色工作液中Mito-Tracker Green的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。

吖啶橙染色怎么用于细胞自噬

游离的叶绿体和细胞内的叶绿体在荧光显微镜下亮度和颜色的区别在于：

在荧光显微镜下，细胞内的叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱，气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。

叶绿体是植物细胞中由双层膜围成，含有叶绿素能进行光合作用的细胞器。叶绿体基质中悬浮有由膜囊构成的类囊体，内含叶绿体DNA。是一种质体。质体有圆形、卵圆形或盘形3种形态。叶绿体含有的叶绿素a、b吸收绿光最少，绿光被反射，故叶片呈绿色。容易区别於另类两类质体──无色的白色体和**到红色的有色体。叶绿素a、b的功能是吸收光能，少数特殊状态下的叶绿素a能够传递电子，通过光合作用将光能转变成化学能。叶绿体扁球状，厚约2.5微米，直径约5微米。具双层膜，内有间质，间质中含呈溶解状态的酶和片层。片层由闭合的中空盘状的类囊体垛堆而成，类囊体是形成高能化合物三磷酸腺苷(ATP)所必需。是植物的“养料制造车间”和“能量转换站”。能发生碱基互补配对。

核酸电泳染色剂有哪些

细胞自噬预实验

化学染色法

1、 试验目的

通过化学染料吖啶橙（acridine orange，AO）染色木犀草素处理后的HepG2细胞判断木犀草素是否诱导HepG2细胞发生自噬。

2、 试验原理

3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔**或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。AO也可以渗透进入酸性细胞器，例如自噬溶酶体，发生自噬的细胞经吖啶橙染色，在荧光显微镜下可观察到红**点状体，称为酸性小体，当PH值较低的时候，AO发出红色荧光，且强度与酸性程度相关。所以在AO标记的细胞中，酸性囊泡细胞器结构可以通过荧光显微镜下观察到。

电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂：

1、溴化乙锭（ethidium bromide, EB）

最常用的核酸荧光染料，可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。 EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶 浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这 样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。

在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了 核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光 易分解，应于4℃避光保存，

2、吖啶橙（acridine orange, AO）：

吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发 下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在 22℃，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。

3、银（Ag+）试剂：

Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及 RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的 RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA 片段回收的制备。

4、亚甲蓝（methylene blue）

可将RNA染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长。染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用净水洗5~8h（反复换水），带型肉眼可见，最低检测量为 250ng。