吖啶酯标记抗体实验方法-吖啶酯作为发光剂的化学发光免疫测定中叙述错误的是

2024-11-19 17:17:24

化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种:

(1)化学发光标记免疫分析法;

(2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析( chem ilum inescen t enzym e imm unoassay,

CL E IA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同[ 5 ]: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。常用的底物为鲁米诺(32氨基邻苯二甲酰肼,lum ino l) , 或其衍生物如异鲁米诺(42氨基邻苯二甲酰肼) , 是一类重要的发光试剂。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行, 在过氧化物酶及活性氧[ 过氧化阴离子(O 2- ) , 单线态氧(1O 2 ) , 羟自由基(OH·) , 过氧化氢(H2O 2) ]存在下,生成激发态中间体, 当其回到基态时发光, 其波长为425nm。

早期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体) , 但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体, 进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物, 在过氧化物酶和起动发光试剂(N aOH2H2O 2) 作用下, 鲁米诺发光, 发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。Kodak Am erliteTM 半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的。 (enhanced lum ines2cence enzym e imm unoassay, ELEIA )

在发光系统中加入增强发光剂, 如对2碘苯酚等, 以增强发光信号, 并在较长时间内保持稳定, 便于重复测量, 从而提高分析灵敏度和准确性。在全自动分析仪上, 还可通过计算机严密控制, 进行自动操作, 如加试剂, 混合, 温育, 洗涤, 加发光试剂, 发光计数, 数据处理, 绘制标准曲线, 直至完成病人血清样品的分析并打印出结果。Am erliteTM 发光增强酶免分析系统用荧光素、噻唑等增强剂, 其发光时间可持续长达20m in, 试剂盒有甲状腺功能检测的

促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素, 与性激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮, 以及其他方面的如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。所用底物为环1, 22二氧乙烷衍生物, 这是一类很有前途的发光底物 , 用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团——金刚烷基, 其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团, 在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。最常使用的底物是AM PPD [ 32(2’2 sp iroadam an2tane ) 42m ethoxy242( 3’2 pho spho ryloxy) 2phenyl21,22dioxetane ], 中文名为: 32(2’2 螺金刚烷) 242甲氧基242(3’2 磷酰氧基) 2苯基21, 22环二氧乙烷)。在碱性磷酸酶(AL P) 作用下, 磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基, 得到一个中等稳定的中间体AM PD (半寿期为2～ 30m in) , 此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子, 当其回到基态时产生470nm 的光, 可持续几十分钟(如图5)。AM PPD 为磷酸酯酶的直接化学发光底物, 可用来检测碱性磷酸酯酶或酶和抗体、核酸探针及其它配基的结合物。可检测到碱性磷酸酯酶的浓度为10- 15mo l?L 。

美国DPC 公司的Imm u lite 全自动酶放大发光免疫分析仪, 以碱性磷酸酶为标记物, 以金刚烷作发光底物, 测定灵敏度相当于10- 21mo l?mL 的酶, 采用聚苯乙烯珠作载体, 其检测水平已能达到10- 12g?mL。

化学发光免疫分析仪属于几类仪器

直接参与发光反应的标记物主要是具有在化学结构上能产生发光特殊基团的物质。这类物质在发光免疫分析过程中直接参与发光反应，不需要通过催化反应或能量传递来间接发光。根据公开发布的信息，以下是一些直接参与发光反应的标记物：

1. 吖啶酯类标记物

特点：吖啶酯类标记物在化学结构上有产生发光的特殊基团，它们通过起动发光试剂的作用而发光，能够在极短的时间内（如1秒内）完成强烈的直接发光，为快速的闪烁发光。

应用：吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无需催化剂。检测小分子抗原常采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低。此外，与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加了灵敏度。

2. 其他可能的直接发光标记物

虽然吖啶酯类标记物是最常见的直接参与发光反应的标记物之一，但也可能存在其他类型的直接发光标记物。然而，需要注意的是，并非所有发光标记物都直接参与发光反应，有些可能通过催化反应或能量传递来间接发光。

3. 间接参与发光反应的标记物

酶标记物：如辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们作为发光反应的催化剂或能量传递过程中的受体，通过催化底物发光或参与能量传递来间接发光。

非酶标记物：如三联吡啶钌等，它们可能作为化学反应的催化剂或能量传递过程中的中间体，但不直接参与发光反应，而是通过能量传递等方式影响发光强度。

综上所述，直接参与发光反应的标记物主要是具有在化学结构上能产生发光特殊基团的物质，如吖啶酯类标记物。在化学发光免疫分析中，选择合适的标记物对于提高检测的灵敏度和特异性至关重要

发光底物吖啶酯和鲁米诺哪个更好？

两类

1.化学发光标记免疫分析法　　

化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) ,是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物——acridin ium ester (A E) ,是有效的发光标记物[ 3 ] , 其通过起动发光试剂(N aOH2H2O 2 ) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成,为快速的闪烁发光(见图1)。吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法 ,大分子抗原则采用夹心法 , 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。

2.发光酶免疫分析法　　

从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析( chem ilum inescen t enzym e imm unoassay,CL E IA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂,操作步骤与酶免分析完全相同[ 5 ]: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物,在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) ,它们有各自的发光底物。

体外诊断试剂性能指标——灵敏度

吖啶酯类的直接化学发光剂不需酶的催化作用，只需改变溶液的pH等条件就能发光。

吖啶酯的化学发光量子产率比鲁米诺高，而且吖啶酯标记条件温和，标记率高，标记后不影响分离。

吖啶酯和鲁米诺两者价格也相差很大。武汉德晟生化建议您根据不同实验需要选购不同发光剂

灵敏度评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重要申报材料之一。

灵敏度的定义可以理解为体外诊断试剂对待测样本所能检测到的最小量，有两个含义：①最小浓度或含量的变化可以引起检测信号的显著变化；②具有适当的限度检测出区别于零的待测物的最小浓度或含量。

体外诊断试剂的分析灵敏度也称为检测限，指检测方法可检测到的最低检测浓度，即在统计学意义上能与零剂量区别的量。一般用95％可信限计算：重复测定空白样本20次，计算20次反应测得的均值和标准差（SD），以平均值+2SD（夹心法）或平均值-2SD（竞争法）计算出相应的浓度，即为体外诊断试剂的分析灵敏度，也是注册资料所需提供的内容。

1.分析灵敏度评估需要的材料和基本要求：

空白样本的制备：空白样本应不含被测物，但其基质应与带测定常规样本相同。如空白样本难以获得，可采用5%牛血清或人血清白蛋白溶液，或根据具体项目选择相应基质的样本，但是需要注意的是，要将基质效应减到最小。

2.实验方法：

在一次运行中重复测定空白样本20次。

3.数据处理：

1）数据记录：将结果记录于表格。如果检测系统对于低于零的报告为零，应记录初始响应值。

2）数据统计：计算20次平均值和标准差SD

3）标准差计算公式：

4）结果报告：

分析灵敏度 =?平均值+2SD（夹心法）或平均值-2SD（竞争法）

体外诊断试剂的功能灵敏度与精密度相关，是以天间变异系数（CV）为20%时所对应的检测限样本具有的平均浓度。

1.计算方法：