吖啶酯结构式-吖啶酯标记工艺

2024-11-08 12:09:19

吖啶酯结构式-吖啶酯标记工艺

吖啶酯和三联吡啶钌。

吖啶酯是一类可用作化学发光标记物的化学物质，加入发光启动试剂后0.4s左右发射光强度达到最大，半衰期为0.9s左右。

三联吡啶钌其标记物的发光原理是，一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。

萤火虫荧光素酶（Luciferase）标记肿瘤细胞活体成像技术的方法介绍

答案：D

脑脊液中蛋白质测点常用免疫比浊法。吖啶酯是一类可用作化学发光标记物的化学物质，常用于化学发光法。吖啶酯标记抗原或抗体检测的自动化仪器的设计原理是化学发光免疫测定原理。

吖啶酯怎么读

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，许多大中型城市，乳腺癌已居女性恶性肿瘤亡率的首位。乳腺癌复发转移是导致乳腺癌患者亡的最主要原因，淋巴结阴性的患者中约有24%～30%出现复发转移，淋巴结阳性的患者中复发转移率高达50%～60%，而转移性乳腺癌的5年生存率仅为26%。

萤火虫荧光素酶（Luciferase）是一种常用的信号分子，可以用来标记肿瘤细胞.

一．细胞方法

将带有荧光素luc转酶报告基因的真核表达重组质粒pRc/CMV2-7，利用G418筛选，获得稳染人乳腺癌细胞株MCF-7-luc，并在稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆MCF-7体外评价其发光能力。通过建立裸鼠移植瘤模型，利用活体生物发光成像系统检测肿瘤生长及转移情况，为下一步监测裸鼠移植瘤对药物作用的变化情从而为分析药物对肿瘤的治疗效果提供理想的状况.

G418筛选浓度的确定：

37℃细胞培养箱中常培养,G418按0、200、400、600、800、1000μg/ml设置6个浓度梯度。在细胞接种24h后，加入6孔板中，每个浓度设2个孔在10～14d内全部亡。每天观察细胞生长情况，亡最低的G418浓度，即为筛选质粒转染克隆MCF－7细胞的浓度。

1)细胞转染

取对数生长期的MCF－7细胞，将细胞接种于6孔板内待细胞融合度达到80%～90%孔培养板中，TM即可转染。按照Lipofectamine2000试剂盒操作指南进行转染。在250μl无血清、无双抗的DMEM培培养基中加入luc质粒8μg/ml的pRc/CMV2-在250μl无血清、无双抗的DMEM培养基中加入10μlLipofectamineTM2000，室温培育5min。将上述2种稀释液混匀，室温培育30min后加入细胞孔板中，置于培养箱常规培养。

转染24h后胰酶消化细胞并按1∶6比例接种到新6孔板中，同时加入实验确定的浓度G418，随后每2d更换一次培养基并维持G418筛选直至单细胞抗性克隆的出现。分别挑选单一抗性克隆至96孔板，待其逐渐增殖后转入24孔板中继续传代培养。

3)荧光素酶活性鉴定阳性克隆

单一抗性克隆传代至第五代时用LuciferaseAs-sayAystem检测荧光素酶活性。检测时，各克隆按1×105个/孔接种到24孔板，24h后细胞裂解液裂解12000rpm，4℃离心10min，收集裂解物，取上清10μl加入96孔白板中，向每孔加入50μl荧光素酶96microplateluminometer连续读底物，停留2s后，取10s的荧光值（RLU），每个克隆设3个复孔，保留RLU值高的细胞克隆继续传代培养，再过5代后进行荧光素酶活性检测。保留RLU值维持较高的克隆直至第30代，荧光素酶活性最高的几个克隆MCF-7-luc即为阳性克隆.

各不同数量细胞克隆的荧光值检测7-luc阳性克隆细胞按细胞数将筛出的MCF-4×104、2×104、1×104、5000、2500、1250、625、312和156分别接种到96孔黑板中，另外一组仅有细胞，一组仅有培养基作对照，设置2个复孔，常规培去上清并用PBS洗两次，每孔加入100μl养24h后，Luciferin使其终浓度为150μg/ml，PBS，再加入D-立即用活体成像系统检测，分析发光强度与细胞数之间的相关性。

4)细胞生长曲线绘制

MCF7-luc细胞和作为对照取表达荧光素酶的MCF-7细胞，接种于24孔板，接种密度为2×104/孔。细胞接种后1～7d，每天胰蛋白酶消化其中3孔细胞，用细胞计数仪测定细胞数。以细胞生长天数为横坐标，细胞数目为纵坐标，分别绘制两种细胞生长曲线。

二．动物模型

BLAB/c裸鼠皮下移植瘤模型的建立BLAB/cnu/nu裸鼠，4～5周龄，体重（15±2）g，雌雄各3只。取对数生长期的MCF-7用PBS重悬为2．5×10/ml悬液，每只裸鼠左右背侧近腋部皮下接种100μl，共接种6只。接种后第5d采用德国BERTHOLD公司的活体成像系统检测信号强度。以后每5d观测一连续观测30d。观测前每只裸鼠戊巴比妥钠麻醉（计量为：35mg/kg体重），按150mg/kg体重的量腹腔注射luciferin（invivograde），10min后，进行活体成像观察皮下肿瘤的生长情况，定量分析各时间点的荧光值。绘制肿瘤皮下生长曲线.

MCF-7-luc细胞裸鼠皮下移植瘤的病理形态学观察

MCF-7-luc细胞裸鼠皮下接种后25d，脱颈处小鼠，取肿瘤组织，制成石蜡切片，切片厚度为3μm，经HE染色后观察细胞的病理形态学。

活体动物成像技术是近期发展起来的一种新型稳定可靠,是检测动物体内分子及细胞事件的影像检测技术，强有力手段。利用生物发光成像（BLI）可以对活体病灶的大小进行无损伤直观准确检测。

我们有自己的独立有机合成实验室，可以生产合成各种化学发光试剂，我们可以提供化学发光试剂、化学发光底物、发光标记物、发光增强剂、染料探针类、微生物和酶的显色底物以及体外诊断试剂。

化学发光免疫分析法有哪三类

吖啶酯：ā dìng。

如果吖啶环上的取代基能与吖啶环上的C-9 和H2O2形成不稳定的二氧乙烷（此二氧乙烷可迅速分解为CO2 和电子激发态的N - 甲基吖啶酮，当回到基态时发出光子），则这类取代吖啶化合物可做为化学发光标记物。

根据取代基的不同，常用作化学发光标记物的吖啶取代物分为两类：吖啶酯和吖啶磺酰胺。它们的结构中都有共同的吖啶环。

它们的发光机理相同：在碱性H2O2 溶液中，分子受到过氧化氢离子进攻时，生成不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2 和电子激发态的N - 甲基吖啶酮，当其回到基态时发出最大发射波长为430nm 的光子。

吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于化学发光免疫分析，通常采用的体系是Acridinium ester/ H2O2 系统。

即用吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体或抗原，用HNO3+ H2O2 和NaOH 作发光启动试剂。有些在发光启动试剂中加入Triton X - 100 , CTAC , Tween - 20 等表面活性剂以增强发光。

化学发光免疫分析法有哪三类？

化学发光免疫分析法根据标记物的种类和发光原理的不同，主要可以分为以下三类：

1. 化学发光免疫分析法（CLIA）

特点：

也被称为直接化学发光分析法或非酶促化学发光免疫分析法。

该方法利用化学发光试剂（如鲁米诺类与吖啶酯类）直接标记抗原或抗体。

发光试剂在发光过程中会消耗标记物，导致发光时间较短，属于闪光型发光，因此通常只能进行一次测量，且重复性较差。

应用：

由于其高灵敏度和特异性，广泛应用于各种抗原、抗体、激素等物质的检测。

2. 化学发光酶免疫分析法（CLEIA）

特点：

从标记免疫分析的角度看，CLEIA应属于酶免疫分析，但其酶反应的底物是发光剂。

操作步骤包括首先用酶对生物活性物质进行标记，然后进行免疫反应产生复合物，复合物上的酶再作用于发光底物，最后通过测定发光信号来进行定性或定量分析。

应用：

常用于提高发光信号的强度和稳定性，从而提高检测的灵敏度。

3. 电化学发光免疫分析法（ECLIA）

特点：

以电化学发光剂（如三联吡啶钌）作为示踪物质标记抗原或抗体。

采用纳米微球为固相载体的分离方式，以三丙胺作为电子供体。

通过电场作用诱导结合标记物发光，发光强度与被测物质的浓度呈线性关系，从而实现超微量物质的定量分析。

1、直接化学发光，标记物为吖啶酯（雅培）或者ABEI（新产业）

2、酶促化学发光，标记物为碱性磷酸酶（厦门波生）或者辣根过氧化物酶（强生）

3、电化学发光，标记物为三联吡啶钌（罗氏）

注：括号内为代表厂家。

简介：

化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。