吖啶酯发光波长-吖啶酯发光波长是多少

2017年检验技师考试免疫学考点总结

　免疫学检验是检验技师考试的考点之一。为了方便考生更好的复习关于免疫学检验的知识。下面是我为大家带来的关于免疫学检验的知识，欢迎阅读。

　0、免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应。

　1、免疫：是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能

　2、免疫防御(对外);免疫自稳(防自身免疫病);免疫监视(防肿瘤)。

　3、中枢免疫器官：骨髓、胸腺;外周免疫器官：淋巴结、脾脏(最大)、黏膜相关淋巴组织

　4、B细胞：通过识别膜免疫球蛋白来结合抗原，介导体液免疫;B细胞受体=BCR=mIg

　表面标志：膜免疫球蛋白(SmIg)、Fc受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红细胞受体。

　成熟B细胞：CD19、CD20、CD21、CD22 (成熟B细胞的mIg主要为mIgM和mIgD)同时检测CD5分子，可分为B1细胞和B2细胞。

　B细胞功能检测方法：溶血空斑形成试验(体液免疫功能)。

　5、T细胞：介导细胞免疫。共同表面标志是CD3(多链糖蛋白);辅助T细胞的标志是CD4;杀伤T细胞的标志是CD8;T细胞受体=TCR。

　T细胞和NK细胞的共同表面标志是CD2(绵羊红细胞受体);

　CD3+CD4+CD8- = 辅助性T细胞(Th)

　CD3+CD4-CD8+ = 细胞毒性T细胞(Tc或CTL)(T细胞介导的细胞毒试验)

　CD4+CD25+ = 调节性T细胞(Tr或Treg)

　T细胞功能检测：植物血凝素(PHA)刀豆素(CONA)刺激T细胞增殖。增殖试验有：形态法、核素法。

　T细胞亚群的分离：亲和板结合分离法，磁性微球分离法，荧光激活细胞分离仪分离法

　*E花环试验是通过检测SRBC受体而对T细胞进行计数的一种试验;

　6、NK细胞：具有细胞介导的细胞毒作用。直接杀伤靶细胞(肿瘤细胞和病毒感染的细胞)

　表面标志：CD16(ADCC)、CD56。

　测定人NK细胞活性的靶细胞多用K562细胞株，而测定小鼠NK细胞活性则常采用YAC-1细胞株。

　7、吞噬细胞包括：单核-吞噬细胞系统(MPS，表面标志CD14，包括骨髓内的前单核细胞、外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞)和中性粒细胞。(表达MHCⅡ类分子)

　8、人成熟树突状细胞(DC)(专职抗原呈递功能)：表面标志为CD1a、CD11c和CD83。

　9、免疫球蛋白可分为分泌型(sIg，主要存在于体液中，具有抗体功能)及膜型(mIg，作为抗原受体表达于B细胞表面，称为膜表面免疫球蛋白)

　10、免疫球蛋白按含量多少排序：IgG>IgA>IgM>IgD>IgE五类(按重链恒定区抗原性(CH)排序)

　免疫球蛋白含量测定：单向环状免疫扩散法、免疫比浊法。

　11、免疫球蛋白的同种型抗原决定簇位于恒定区(CH、CL)

　12、抗体由浆细胞产生。抗体分子上VH和VL(高变区)是抗原结合部位。

　13、IgG：血清中含量最高的免疫球蛋白(IgG1最高)，血液和细胞外液中的主要抗体。也是再次免疫应答的主要抗体，是唯一能通过胎盘的抗体，大多数抗菌抗体、抗病毒抗体是IgG，某些自身抗体及超敏Ⅱ型抗体是IgG，免疫学检测中第二抗体也以IgG为主。

　14、IgA：分血清型(单体存在)及分泌型;分泌型IgA(sIgA)为二聚体，性能稳定，主要存在于胃肠道、支气管分泌液、初乳、唾液、泪液中，局部浓度高，是参与黏膜局部免疫的主要抗体。

　15、IgM：为五聚体，主要存在于血液中，是Ig中分子量最大的(又称巨球蛋白)。个体发育最早合成和分泌的抗体。抗原刺激后体液免疫应答中最先产生的抗体，感染过程中血清IgM水平升高，说明近期感染。新生儿脐血中若IgM增高，提示有宫内感染。

　16、IgE：为单体结构，正常人血清中含量最低。IgE为亲细胞抗体，介导Ⅰ型超敏反应。特异性过敏反应和寄生虫早期感染患者血清中可升高。

　17、补体：具有酶样活性的球蛋白(肝细胞、巨噬细胞产生);激活途径主要有三种：经典途径(以结合抗原后的IgG或IgM类抗体为主要激活剂(双链DNA)，C1～C9全部参与)、替代途径(病原微生物细胞壁成分(脂多糖)直接激活补体C3，然后完成C5～C9的激活过程)、MBL途径(由急性炎症期产生的甘露糖结合凝集素(MBL)与病原体结合后启动激活)。

　18、补体系统中C3含量最多，C2含量最少。

　19、灭活：加热56℃30分钟，补体丧失活性

　20、补体清除免疫复合物的方式：吞噬调理;免疫粘附;免疫复合物抑制。

　21、完全抗原=反应原性+免疫原性。半抗原=反应原性(无免疫原性)

　22、抗原抗体结合力(分子间引力)：静电吸引、范德华力、氢键、疏水作用力(最强)

　23、抗原抗体反应的四大特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性;受反应条件(如温度、pH、电解质、抗原抗体比例等)的影响。

　24、抗体过量前带;抗原过量后带(钩状效应)

　25、抗原抗体反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应;第二阶段为可见反应阶段，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。

　26、颗粒性抗原出现凝集反应。可溶性抗原出现沉淀反应。单价抗原与相应抗体结合不出现沉淀现象。

　27、木瓜酶水解IgG为2Fab+Fc;胃蛋白酶水解IgG为F(ab)2+nFc。

　28、最常用于免疫动物的佐剂是弗氏佐剂，弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂(弗氏不完全佐剂加卡介苗)和弗氏不完全佐剂两种。

　29、R(兔子)型抗血清是用家兔及其他动物免疫产生的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较宽，适于作诊断试剂。

　H(马)型抗血清是用马等大动物免疫获得的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较窄，一般用作免疫治疗。

　30、抗血清常见保存条件：2-8℃保存;冷冻保存(最常用);真空干燥保存(5-10年)。

　31、杂交瘤细胞放入液氮(-196℃)前，需要逐步降温。复苏细胞时，从液氮罐内取出冻存管，立即浸入37℃水浴。

　32、凝集反应分为两个阶段：①抗原抗体的特异性结合;②出现可见的颗粒凝聚。

　33、直接凝集反应的原理是细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质(0.85%氯化钠)参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。抗原=凝集原，抗体=凝集素。

　34、玻片凝集试验：主要用于抗原的定性分析，AB0血型的测定。

　试管凝集试验：肥达氏试验、外斐试验、输血交叉配血试验;

　35、红细胞包被抗原，用以检测抗体的血凝反应，称为正向间接血凝反应(PHA)。

　红细胞包被抗体，用以检测抗原的血凝反应，称为反向间接血凝反应(RPHA)。

　36、间接血凝抑制试验：可用于检测抗体、自身抗体、变态反应性抗体，也可测定抗原。

　37、金**葡萄球菌A蛋白(SPA)

　38、血凝试验可在微量滴定板或试管中进行，将标本倍比稀释，一般为1:64，同时设不含标本的稀释液为对照孔。凡红细胞沉积于孔底，集中呈一圆点的为不凝集。如红细胞凝集，则分布于孔底周围。

　39、明胶凝集试验(间接)：HIV-1抗体和抗精子抗体检测

　40、抗球蛋白试验，又称Coombs试验，是检测抗红细胞不完全抗体的一种很有用的方法。包括直接Coombs试验(检测红细胞上的不完全抗体)和间接Coombs试验(游离在血清中的不完全抗体)

　41、沉淀反应分两个阶段：第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见。第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。

　42、免疫比浊：最适pH为6.5～8.5，磷酸盐缓冲液。

　43、对流免疫电泳：抗体流向负极，抗原流向正极

　44、免疫固定电泳也用予尿液中本-周蛋白的检测及?、?分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型。

　45、RIA(放免)核素(125Ⅰ)标记抗原，竞争抑制(标记抗原和非标记抗原竞争限量抗体);IRMA(免疫放射)核素标记抗体，非竞争结合(过量标记抗体，反应速率比RIA快，灵敏度明显高于RIA。)

　RIA可以测定大分子和小分子抗原，但IRMA则只能测定至少有两个抗原决定簇的抗原。

　46、常用的荧光素有：异硫氰酸(FITC)黄绿色，最常用;四乙基罗丹明(RB200)橘红色;四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)橙红色;藻红蛋白(R-RE)橙色。其他：铕(Eu3+)

　47、荧光标记蛋白的常用方法：搅拌法和透析法。

　荧光抗体效价鉴定：抗原含量为1g/L时，抗体效价>1：16

　48、时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)以镧系元素(如：铕)化合物为荧光标记物。

　49、偏振免疫测定的偏振波长是485nm(蓝光)。

　50、辣根过氧化物酶(HRP)：底物(1)邻苯二胺(OPD)，(2)四甲基联苯胺(TMB) ELISA中应用最广泛的底物。

　碱性磷酸酶(ALP)：底物：对-硝基苯磷酸脂(p-NPP)

　?-半乳糖苷酶(?-Gal)：底物：4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷(4-MUU)

　51、异相法：先分离，后测定;均相法：不分离，直接测。

　52、酶联免疫吸附试验(ELISA)：

　必要的试剂：①固相的抗原或抗体;②酶标记的抗原或抗体;③酶反应的底物。

　抗原测定：蛋白大分子抗原用得最多的是双抗体夹心法(HBsAg)。只有单个抗原决定簇的小分子，则使用竞争抑制法。

　抗体测定：通常使用间接法(HCV、HIV)、双抗原夹心法(HBsAb)、竞争法(HBcAb、HBeAb)和捕获法(IgM)等

　*待测孔最后显示的颜色深浅与标本中的待测抗原或抗体呈正相关的是：双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体;

　53、化学发光底物有：直接化学发光剂：吖啶酯和三联吡啶钌;酶促反应发光剂：(标记酶HRP)鲁米诺及其衍生物、(标记酶为碱性磷酸酶)AMPPD;

　54、免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。

　55、外周血单个核细胞的分离的分层液常用：Ficoll(由上到下为血浆，单个核细胞，粒，红)和Percoll(由上至下：细胞，单个核细胞，淋，红，粒)。

　56、纯淋巴细胞群的采集有：黏附贴壁法，吸附柱过滤法，磁铁吸引法，Percoll分离液法。

　57、T细胞和B细胞的分离：E花环沉降法，尼龙毛柱分离法

　58、淋巴细胞活力测定：台盼蓝染色法，细胞为蓝色。

　59、CD4是HIV受体，HIV感染时CD4/CD8比值明显降低。

　60、CD4/CD8升高常见于自身免疫性疾病;而CD4/CD8降低常见于病毒感染、恶性肿瘤和再生障碍性贫血等。

　61、(ELISA)双抗体夹心法是用于细胞因子测定的最常用方法。

　62、流式细胞仪：前向散射光(FS)反映颗粒的大小。侧向散射光(SS)反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度。荧光(FL)反映颗粒被染上荧光部分数量的多少。

　63、免疫荧光标记最常用的荧光染料：异硫氰酸荧光素(FITC)亮绿色荧光。德州红红色荧光。藻胆蛋白类橙色至红色荧光。

　64、临床上常用三色荧光抗体标记将CD3-CD16+CD56+淋巴细胞确定为NK细胞。

　65、AIDS患者的一个特征性免疫诊断指标表现为：T淋巴细胞总数减少，T细胞亚群CD4Th/CD8Tc比例倒置，Th/Tc<1.0，Th细胞数量显著下降甚至测不出，而Tc细胞数量可正常或增加，NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞群则处于正常范围。

　65、强直性脊柱炎HLA-B27

　66、SLE患者以IgG、IgA升高较多见。类风湿关节炎患者以IgM增高为主。

　67、M蛋白(MP)是B淋巴细胞或浆细胞单克隆异常增殖(>30g/L)所产生的一种在氨基酸组成及顺序上十分均一的异常单克隆免疫球蛋白。多无免疫活性，故又称副蛋白。临床上多见于多发性骨髓瘤、高丙种球蛋白血症、恶性淋巴瘤、重链病、轻链病等

　68、M蛋白-最基本方法：血清蛋白区带电泳技术

　M蛋白-粗筛试验：血清免疫球蛋白定量(单向琼脂免疫扩散法和免疫比浊法)

　M蛋白-鉴定，首选方法：免疫固定电泳(IFE)技术(区带电泳技术与特异性抗血清的免疫沉淀反应相结合)是临床最常用的方法。

　69、IgD降低见于原发性无丙种球蛋白血症、矽肺

　70、CSF中的浓度：IgG>IgA>IgM。神经系统肿瘤时，以IgA和IgM升高为主。

　(感染、血管病变、系统性疾病=IgG升高)

　71、本-周蛋白即尿中游离的免疫球蛋白轻链。尿中可测得，血中呈阴性(原因是本-周蛋白分子量小，极易迅速自肾脏排出，血中含量并不升高)

　72、冷球蛋白又称冷免疫球蛋白，在-4℃时发生沉淀，于37℃时又复溶解。采血是冷球蛋白检测的关键，宜在体温条件下采集和保存静脉血。

　73、补体结合试验(CFT)，梅毒的诊断，华氏反应。

　74、非均相荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定法。

　均相荧光免疫测定：荧光偏振免疫测定法。

　75、链球菌感染：ASO(胶乳凝集试验、免疫散射比浊法)

　76、伤寒沙门菌有菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原和表面(Vi)抗原。肥达反应，效价?1:80为阳性

　77、卡氏肺孢菌，又称卡氏肺孢子虫，为类真菌。

　78、Ⅰ型超敏反应：由特异性IgE抗体介导产生，其发生速度最快。(青霉素、支气管哮喘)

　提高Th1细胞活性，减少IL-4的分泌，可降低IgE的产生，阻断IgE介导的Ⅰ型超敏反应。

　参与Ⅰ型超敏反应：肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞。

　79、Ⅱ型超敏反应：又称细胞毒型或细胞溶解型超敏反应，它是由靶细胞表面的抗原与相应IgG或IgM类抗体结合后，在补体(细胞溶解)、巨噬细胞(吞噬)和NK细胞(ADCC作用)参与下，引起的以细胞溶解或组织损伤为主的病理性免疫反应。(输血反应、新生儿溶血症、自身免疫性溶血性贫血、药物过敏性血细胞减少症、肺出血肾炎综合征、甲状腺功能亢进)

　80、Ⅲ型超敏反应：由可溶性免疫复合物沉积于局部或全身多处毛细血管基底膜，通过激活补体，并在血小板、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞等的参与下，引起的以充血水肿、局部坏和中性粒细胞浸润为主要特征的炎症反应和组织损伤。(Arthus反应、类Arthus反应、血清病、链球菌感染后肾小球肾炎、类风湿关节炎、SLE)/81、Ⅳ型超敏反应：又称迟发型超敏反应(DTH)，是效应T细胞与特异性抗原结合后，引起的以单个核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎症反应。(细胞免疫)效应性CD4+Th1细胞识别抗原后活化，可释放IFN-?、TNF、淋巴毒素(LT)、IL-3、GM-CSF、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等多种细胞因子。

　常见Ⅳ型超敏反应性疾病：感染性迟发型超敏反应(结核分枝杆菌、病毒、原虫)、接触性皮炎、移植排斥反应。(结核菌素皮试、斑贴试验)

　82、变性的IgG可刺激机体产生抗变性IgG抗体(类风湿因子)

　83、ITP患者血清中存在有抗血小板抗体，该抗体可以缩短血小板的寿命。

　84、抗乙酰胆碱受体抗体：对重症肌无力(MG)具有诊断意义。

　85、毒性弥漫性甲状腺肿患者血清中有抗促甲状腺激素受体(TSHR)的IgG型自身抗体。(甲状腺功能的'亢进)

　86、多发性肌炎是以损害肌肉为主要表现的自身免疫性疾病，如果同时有皮肤损害，则称为皮肌炎。

　87、75%的PSS患者有抗核抗体阳性，抗Scl-70抗体是PSS的特异性抗体，80%～95%的局限性硬皮病患者抗着丝点抗体阳性。

　88、自身免疫病(AID)的特征：高滴度自身抗体，病理特点为免疫炎症损伤与抗原分布一致，能建动物模型。

　89、抗DNP抗体(抗核蛋白抗体)通常完全被DNA和组蛋白吸收，是形成狼疮细胞的因子。

　90、ANA阳性的荧光现象分：核膜型、均质型、斑点型、核仁型。ANA常为自身免疫病的初筛试验。

　91、ENA是可提取核抗原的总称，分子中不含DNA。

　92、抗dsDNA抗体对SLE有较高的特异性。抗Sm抗体也是SLE的特异性标志之一。此两项常为SLE确诊指标。(对疑为SLE的患者，应先进行ANA和抗dsDNA抗体的检测，当ANA和(或)抗dsDNA抗体阳性时，再作抗ENA抗体谱的检测。如有抗Sm抗体和(或)抗RNP抗体阳性，可实验室诊断为SLE)

　93、抗核RNP抗体：为MCTD(混合性结缔组织病)的诊断指标。

　94、抗SSA/抗SSB抗体：为干燥综合征(SS)的诊断指标。(当ANA阳性而抗dsDNA抗体阴性，抗ENA抗体谱中抗SsA抗体和(或)抗ssB抗体阳性，可实验室诊断为干燥综合征。)

　95、抗Jo-1抗体：多发性肌炎(PM)患者常为阳性。

　96、抗Scl-70抗体：进行性系统性硬皮症(PSS)的诊断指标。

　97、NCA：原发性小血管炎的特异性血清标志物

　98、内风湿性关节炎(RA)：自身抗体有RF、抗角蛋白抗体(AKA)、抗环瓜氨酸肽抗体(anti-CCP)。

　99、Farr法测定dsDNA抗体的特异性高，为公认标准法，当抗dsDNA抗体结合率大于20%时对SLE有意义。

　100、抗线粒体抗体(AMA)：原发性胆汁性肝硬化

　101、巨球蛋白血症：以分泌IgM的浆细胞恶性增殖为病理基础的疾病。好发于老年男性，主要表现骨髓外浸润，以肝、脾和淋巴结肿大为主要体征并伴有血黏滞过高综合征，如表现为视网膜出血。(血清呈胶冻状难以分离，电泳时血清有时难以泳动，集中于原点是该病的电泳特征)

　102、异常免疫球蛋白检测的应用原则

　初筛实验：区带电泳分析、免疫球蛋白定量检测和尿本-周蛋白定性检测。

　确证实验：免疫电泳、免疫固定电泳、免疫球蛋白亚型、血清及尿中轻链蛋白的定量检测。

　103、HIV诱导的免疫应答

　1.体液免疫应答HIV感染后，机体可产生：中和抗体、抗P24壳蛋白抗体、抗gp120和抗gp41抗体

　2.细胞免疫应答：CD8+T细胞应答、CD4+T细胞应答。

　104、HIV抗原检测：核心抗原p24(ELISA)

　105、免疫印迹法判断标准为：①HIV抗体阳性：至少有两条膜带(gp41/gp120/gp160)或至少一条膜带与p24带同时出现;②HIV抗体阴性：无HIV抗体特异性条带出现;③HIV抗体可疑：出现HIV特异性条带，但带型不足以确认阳性者。

　CD4+T细胞计数是反映HIV感染患者免疫系统损害状态的最明确指标。当CD4+T细胞低于500/?l，则易机会性感染;低于200/?l，则发生AIDS。

　106、CEA大于60?g/L时可见于结肠、胃、肺癌。手术6周后CEA水平正常。

　107、AFP原发性肝癌。PSA前列腺癌

　108、糖类抗原有：CA125：上皮性卵巢癌和子宫内膜癌;CA15-3：乳腺癌;CA19-9：胰腺癌、结直肠癌。

　109、神经母细胞瘤和小细胞肺癌(基因有P53，RB)的标志物：神经元特异性烯醇化酶(NSE)

　110、排斥反应有：宿主抗移植反应(HVGR)和移植物抗宿主反应(GVHR)。

　111、移植物存活与HLA配型的关系是：①供、受者HLA-A和HLA-B相配的位点数越多，移植物存活几率越高;②供、受者HLA-DR位点相配更重要，因为HLA-DR和HLA-DQ基因有很强的连锁不平衡，DR位点相配的个体，通常DQ位点也相配;③不同地区HLA匹配程度与移植结果的关系有着不同的预测价值。

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Debye散射是

红灯是为了照明，因为溴化银底片对蓝紫色光较较敏感而对红光几乎无反应，又因为在暗室，你在可见光下才能操作，红光属于可见光。压片现在的技术主要还是根据化学发光法的原理，具体原理如下：（也是网上查资料查出来的，你也可以自己去查）

发光剂是指在发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，根据上述发光特点可将发光剂分为荧光素、生物发光剂和化学发光剂三种。下面主要叙述化学发光免疫技术中常用的化学发光剂或发光底物。

1）酶促反应的发光底物 是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物，目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。也就是常常用来标记二抗的HRP和AP。

HRP的发光底物为鲁米诺或其衍生物和对-羟基苯乙酸（HPA）。

AP的发光底物为3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物），CDP-STAR。

（1）鲁米诺或其衍生物:

鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.1mol/L pH8.6Tris缓冲液作底物液。

要注意是:首先,鲁米诺和H2O2在无HRP催化时也能缓慢自发发光，而在最后光强度测定中造成空白干扰，因而宜分别配制成2瓶试剂溶液，只在用前即刻混合;其次, HRP发光增强剂如某些酚试剂（如邻－碘酚）或萤火虫荧光素酶可增强HRP催化鲁米诺氧化的反应和延长发光时间，提高发光敏感度。

（2）对-羟基苯乙酸（HPA）:

对-羟基苯乙酸（HPA）在H2O2存在下被HRP氧化或氧化二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光，可用荧光光度计测量。

（3）AMPPD:

AMPPD在碱性条件下，被ALP酶解生成相当稳定的AMP-D阴离子，其有2-30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度达到高峰，15-60min内光强度保持相对稳定。

（4）4-MUP:

4-MUP被ALP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的激发光的作用下，发出448nm的荧光，用荧光光度计进行测量。

（5）CDP-STAR试剂

CDP-Star是通过dioxetane在碱性磷酸酶的激活作用下以持续的速度发出光信号来进行检测，灵敏度高，发光时间从几分钟开始可以延续数天，所以可多次曝光并对曝光时间进行优化。是目前最快速、最灵敏的化学发光底物，曝光时间只需15-60秒。当在尼龙膜上以1:100稀释在检测缓冲液中时，CDP-Star的光信号可以在15分钟内达到最大并且缓衰减达3天以上。特别适用于检测哺乳动物的单拷贝基因、检测极少量的靶DNA，如制作指纹图谱及法医分析。

2）直接化学发光剂 这类发光剂不需酶的催化作用，只需改变溶液的pH等条件就能发光的物质，如吖啶酯（acridinium, AE）在有过氧化氢的稀碱溶液中即能发光。

3）电化学发光剂 是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+（图16-7）和电子供体三丙胺（TPA）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，成为强氧化剂，TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+，它很不稳定，可自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA.，成为一种很强的还原剂，可将一个高能量的电子递给三价的[Ru(bpy)3]3+使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+.。激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出一个波长为620nm的光子，回复到基态的三联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强。

3.化学显色法

1）HRP-DAB显色法:

①DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C各1滴,混匀.

②显色:将适量DAB显色液平铺在Ab2杂交后的印迹膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色带

③终止:用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应.

2）AP-NBT/BICP显色法：

每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。

4.底物化学发光ECL（一些具体操作）

（1）HRP-ECL发光法：

将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

（2）AP的发光自显影：

AP的发光底物是金刚烷二氧丁环磷酸盐（AMPPD），它含有磷酸酯键在AP的作用下水解下一个磷酸，进而由分子内过氧键提供能源分解产生金刚酮和激发态的甲基间-氧苯甲酸阴离子，当此阴离子恢复到基态时发出光子。可用波拉黑白片（621型）直接暴光显影。显影信号强度比BCIP/NBP显色法强两上数量级。是很前景的显示体系。

5.其他

酶促反应比同位素安全且快速，已经成为Western Blot的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高——随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pg级别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase）：

一、HRP：

HRP 辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物2大类:

1. 化学发光底物：

化学发光底物主要考虑的是：发光信号强弱——发光信号当然越强越好，强发光信号持续的时间——也是越长越好，还有就是背景低灵敏度高。

Luminol是经典的HRP化学发光底物。GE Healthcare（原安玛西亚）的ECL堪称是经典。

除了拥有王牌产品ECL的GE公司，化学发光底物方面不得不提到Pierce公司。Pierce拥有世界上最优秀的HRP化学发光底物生产技术——世界上许多知名的化学发光底物试剂盒厂商都采用PIERCE提供的化学发光底物作为生产原料。其中最耀眼的璀璨之星是SuperSignal系列。

SuperSignal灵敏度高（有10{-12}g级，10{-14}g级，10{-15}g 级选择），发光持久（6-24小时），可反复曝光，稳定性好（室温贮藏6个月，4℃至少是12个月），节约抗体（由于灵敏度高，一抗二抗稀释倍数是同类产品的10倍以上，这对于宝贵一抗来说十分重要）。

2.生色底物：

HRP的生色底物显色有DAB，4-CN ，CN/DAB，AEC和TMB等（而得到可溶性产物的底物如OPD，ABTS等则适用于ELISA）中，与化学发光法中的酶促基团发光不同，底物显色主要是利用底物在有HRP和过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测WB的结果。

最熟悉的底物应该是3’3′二氨基联苯胺DAB，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒。

二、AP：

Western Blot检测系统中常用交联酶两大家族中的另外一类就是AP——碱性磷酸酶。碱性磷酸酶很早就被用于检测系统——包括固定化抗原（WB）检测和核酸检测。

但是做过AP实验的经常会遇到膜上显色背景偏高的问题，所以就WesternBlot本身来说偏爱HRP的要比AP多——分子克隆III解释说由于在我们常用的封闭剂：脱脂奶粉和牛血清白蛋白BSA中富含AP，这样当然显色背景会高。所以分子克隆III推荐的AP适用封闭剂是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol EDTA 65度加热一小时确保AP失活后再用于封闭。

一些研究的样本自身也含有较高水平的碱性磷酸酶，虽然实验上很容易实现抑制内源AP影响，但实际上容易被忽略。AP显色底物生成的产物主要是蓝紫色，成像性好容易拍照。早些年前，AP检测的灵敏度比HRP高，但是背景也偏高，整个显色过程更有“技术性”，有许多个人技巧在里面，让人取舍两难。

如今由于HRP的化学发光底物已经不断改进而使得灵敏度不断提高，化学发光显色上HRP和AP不相上下，但是生色反应来说，AP显色的灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。

AP作为一种经典常用的显色交联酶，自有其优点，比如AP的底物显然更稳定，不像HRP那样需要新鲜配制的H2O2一类的不稳定成分，作为试剂盒可以保存时间更长，特别是习惯用显色方法检测WB结果的。就像HRP可以用于化学发光和底物显色一样，AP也有这两种常用的检测方法的不同底物。AP显色的灵敏度就已经可以达到低皮克级，前提是封闭要做得好。常用的是BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3’-Indolyphosphate p-Toluidine Salt) ，NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride)和INT。

几乎出显色剂的厂家都会生产到这几种底物，比如Roche的BCIP和INT/BCIP ，Pierce的BCIP/NBT，其中以BCIP/NBT灵敏度最高，显色也比较锐利，成像性比较好，因此也就最常用到。预配的即用型显色底物不存在颗粒性底物，较少产生斑点背景。NEB和Initrogen也有完整的检测试剂盒。

最常用的是HRP+GE healthcare得ECL曝光显色试剂。

吖啶酯怎么读

答案：B

免疫比浊分析法主要用于检测血浆、体液中的特定蛋白系列，如免疫球蛋白、补体、尿微量蛋白系列等；吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标记抗体或抗原的免疫分析法；全自动微孔板式ELISA分析仪是用参与催化某一反应的酶来标记抗原或抗体，常用标记酶有辣根过氧化物酶( HRP)和碱性磷酸酶(ALP)；电化学发光免疫分析仪是采用电化学发光技术、生物素放大技术，以顺磁性微粒为固相载体，用三联吡啶钌标记抗原或抗体，三丙胺( TPA)为电子供体，而设计的一种自动化分析仪器；异硫氰酸荧光素( FITC)是免疫荧光标记最常用的荧光探针。

吖啶酯：ā dìng。

如果吖啶环上的取代基能与吖啶环上的C-9 和H2O2形成不稳定的二氧乙烷（此二氧乙烷可迅速分解为CO2 和电子激发态的N - 甲基吖啶酮，当回到基态时发出光子），则这类取代吖啶化合物可做为化学发光标记物。

根据取代基的不同，常用作化学发光标记物的吖啶取代物分为两类：吖啶酯和吖啶磺酰胺。它们的结构中都有共同的吖啶环。

它们的发光机理相同：在碱性H2O2 溶液中，分子受到过氧化氢离子进攻时，生成不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2 和电子激发态的N - 甲基吖啶酮，当其回到基态时发出最大发射波长为430nm 的光子。

吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于化学发光免疫分析，通常采用的体系是Acridinium ester/ H2O2 系统。

即用吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体或抗原，用HNO3+ H2O2 和NaOH 作发光启动试剂。有些在发光启动试剂中加入Triton X - 100 , CTAC , Tween - 20 等表面活性剂以增强发光。