吖啶合成-吖啶类物质作为一种诱变剂主要引起碱基对的置换

打开煤焦油宝库

在欧洲，干馏煤以制取焦炭用于炼铁，是从18世纪初期开始的。随着煤焦化的发展，出现大量煤焦油，除了从其中提取照明灯用油外，只是少量用在铁路轨道的枕木防腐和作为橡胶的溶剂供涂敷防雨布用，大量又黑又臭的油污染着环境，促使化学家们分析研究煤焦油。

首先从煤焦油中分离出来的化学物质是萘。英国皇家研究院化学教授布兰德（William Thomas Brande，1788-1866）在1819年从蒸馏煤焦中发现一种白色结晶体，分析测定它是碳和氢的二元化合物。1820年英国化学工业企业家加登（Alexander Garden，1757-1829）也从煤焦油中获得这一物质。同年，英国牛津大学化学教授基德（John Kidd，1780-1851）将它命名为naphthalene，来自naphtha（石脑油）。石脑油是指石油、煤焦油的最先馏分，萘就是从这个馏分中分离出来的。这也说明了萘是最早从煤焦油中分离出来的。

萘是一种白色结晶体，易挥发，易升华（即易由固体直接转变成气体），具有特殊气味，能除虫防蛀，常代替樟脑用作驱虫剂。萘还是制造染料、药物等的原料。

英国著名化学家、物理学家法拉第在1826年分析了萘，确立它的化学式是C20H8（按碳的相对原子质量等于6计算得到，如果按现在相对原子质量等于12计算，即得出现代萘的正确化学式C10H8）。法拉第还制得萘的两种硫酸的衍生物。

接着1832年法国化学家杜马（Jean Baptiste Hndré Dumas，1800-1884）和他的学生罗朗（August Laurent，1807-1853）发表论说，叙述他们从煤焦油中分离出一种不同于萘的无色固体物，最初认为是萘的同分异构体，即分子式相同、结构式不同的两种化合物，称它为paranaphthalene（异萘）。后来确定它的化学式是C14H10，不同于萘，从希腊文anthrax（煤）命名它为anthracene，我们译成蒽。

蒽是无色固体，具有微弱的蓝色荧光，也会升华，是合成染料的原料。

用作非磁性金属表面探伤荧光剂；芘是合成染料的原料。

在这期间，1834年德国化学家龙格在煤焦油中添加酸溶液后加热，当溶液中和后分离出一种油，再将此油蒸馏分离成三部分，分别称为kyanol（德文，来自希腊文kyanos，蓝色）、pyrrol（德文，来自希腊文pyrros，红色）和leukol（德文，来自希腊文leukos，白色）。朗格将分离出油后的另一部分物质溶解在苛性碱溶液中，从该溶液中又分离出一种油，添加无机酸后又获得另一物质，称为karbols?ure（德文，石炭酸）。

到1843年，德国化学家霍夫曼（August Wilhelm von Hofmann，1818-1892）分析研究了朗格所发现的kyanol是苯胺，leukol是喹啉，karbls?ure是含有甲酚的不纯苯酚，pyrrol保留了它的名称，我们称为吡咯，又称氮杂茂。

苯胺是在1826年被德国化学制品商人恩弗多尔本（Otto Unverdorben，1806-1873）从干馏靛蓝中发现的，认识到它易与酸化合，形成结晶盐，就称它为kristallin（德文，结晶体）。到1840年，德国药剂师弗里茨舍（Carl Julius Fritzsche,1808-1871）将靛蓝与苛性钾作用后也得到苯胺，称它aniline，我们音译成“安尼林”，这一词来自阿拉伯文al-nil（蓝色物质，是葡萄牙人对靛蓝的称谓）。后来到1842年俄罗斯化学家齐宁利用硫化铵作用于硝基苯获得苯胺，称为benzidam（从benzen（苯）来）。霍夫曼在1843年从煤焦油中分离出一种碱性油状物，经过分析确定它和kristallin、aniline、benzidam以及kyanol是同一物质，确定它的化学式是C6H5NH2，保留了aniline这一名称。

苯胺是无色油状液体，遇漂白粉呈现蓝色，这就是龙格从希腊文中蓝色一词命名它的原因。苯胺是合成染料、药物、塑料等的原料。

喹啉后来在1842年由法国化学家热拉尔将马钱子碱、辛可宁、奎宁和苛性碱共同蒸馏取得，确定它的化学式是C9H7N，从quinine（奎宁）命名它为quinoline，我们从音译，又称氮杂萘。它是一种无色有特臭的油状液体，是合成药物的原料。

苯酚俗称石炭酸，1841年再次被罗朗从煤焦油中分离出来，确定它与龙格发现的石炭酸是同一物质。接着热拉尔加热水杨酸（邻羟基苯甲酸）和石灰制得苯酚，研究认为它不是真正的酸，而与醇相似，命名为phenol，表明其分子中含有pheny（苯基）和hydroxyl（羟基），分子式为C6H5OH。

苯酚是无色结晶体，具有特殊气味，在空气中会氧化而变成粉红色。苯酚是合成染料、塑料、农药的原料，医学上用作消毒防腐剂，用它制成药皂因它在空气中易氧化成粉红色就干脆制成红色。

甲酚后来在1851年由德国化学家斯塔德勒（G．St?deler）从母牛尿中发现。1855年英国大学学院化学系教授威廉森（Alexander William Williamson，1824-1904）的一个学生弗尔利（J．Fairlie）从煤焦油馏出的杂酚油中也发现了甲酚。杂酚油是复杂的混合物，直到1864年，德国化学家缪勒（Hugo Müller）发表分析杂酚油的结果，指出其中除含有苯酚、甲酚外，还含有苯三酚（C6H3（OH）3）等。

甲酚又称克利沙尔，是从西方名称cresol译音而来的，来自西方杂酚油的名词creosote。甲酚也用作消毒剂和农药。

龙格发现的吡咯在1851年被英国化学家安德森（Thomas Anderson，1819-1874）从骨焦油中再次发现，给出它的正确化学式C4H5N，吡咯是制药的原料。

苯也是在煤油中发现的。

在欧洲，一直到19世纪20年代，各国人们照明是点燃动植物油脂。有一种是鱼油，是将蒸馏鳕鱼、鲸鱼油获得的气体加压装瓶使用，在瓶底常常有残留气体凝结成的液体。1825年4月法拉第从这种液体中分离出一种液体，在80℃沸腾，在7.2℃凝固。法拉第分析了它的组成，是碳和氢的化合物，碳和氢的质量比为11.4:1，接近12:1。他采用氢的相对原子质量等于1，碳的相对原子质量等于6，得出这一化合物的分子式为C2H，称它为二碳化氢。他还研究了这一新化合物的一些性质：它与浓硫酸作用后生成一种烃基硫酸盐（Sulfovinate,RSO4M）；它与氯气在日光照射下作用，生成盐酸和一种结晶固体物（六氯化苯，俗称六六六）。

1834年德国结晶学家、化学家米切里希Eilhard Mitscherlich，1794-1863）将1份安息香酸（苯甲酸）和3份消石灰共同蒸馏，得到法拉第发现的二碳化氢，将此化合物称为benzin（德文）。

安息香酸存在于安息香树胶中，是一种芳香的树脂，Styrax benzoin（安息香树科，拉丁名称）也就是benzin这一词的来源。德国化学家李必希（Justus Liebig,1803-1873）将此名改为benzol，至今保留在德文中。英文和法文中的benzene由此而来，我们从此词第一音节音译为苯。

1834年李必希指出苯存在于煤焦油中。霍夫曼也在1845年指出苯存在于煤焦油中。当时霍夫曼在英国皇家学院任教，指导他的学生曼斯费尔德（Charles Blachford Mansfield，1819-1855）分馏煤焦油提取苯，在1849年从煤焦油中不仅分离出大量苯，还分离出甲苯、二甲苯等物质。曼斯弗尔德后来却不幸于苯蒸气遇火发生的爆炸中，他在分馏煤焦油过程中创立（部）分（蒸）馏法，该法在分离煤焦油以及其他液体混合物各组分中起了重要作用。

苯的平面六角形结构式（图27-1）是德国化学家凯库勒（Friedrich August Kekulé，1829-1896）于1865年在研究元素化合价的同时提出来的。他在1860年发表的文章中还把苯、萘、蒽和它们的衍生物统称为芳香族化合物（aromatic compound）。芳香族化合物本来是指由各种香树脂中提取的具有芳香气味的物质，但是用气味作为分类物质的依据是不适合的，在经过研究苯、萘、蒽、酚、甲苯等的分子结构后，确定它们都是苯和苯的衍生物，因此用芳香族化合物统称，其实这些化合物中有些具有令人不愉快的臭味。

苯、萘、蒽等的命名在西方都采用“-ene”的词尾，我们都采用它们名称的第一音节译音，添加草字头，创造一个新字。五节环命名为茂。

萘、蒽等分子结构中具有多环，称为稠环化合物，是德国化学家格雷伯和利伯曼在1868年提出来的。

吡啶、喹啉等分子结构的环状结构中除碳原子外还含有氮、氧、硫等原子（图27-1），统称为杂环化合物，分别是德国化学家克尔纳（Wilhelm K?rner，1839-1925）和英国化学家杜瓦（James Dewar，1842-1923）在1869年确定的。

从煤焦油中分离出来的稠环化合物还有芴（fluorene，C13H10）和苊（acennaphthene,C12H10），是法国化学家贝特洛（Pierre Eugéne Marcellin Berthelot，1827-1907）分别在1867年和1872年从蒸馏煤焦油所得的粗蒽中发现的。芴是一种无色晶体，发放紫色荧光，因而从希腊文fluor（荧光）得名，是有机合成的原料。苊也是一种无色晶体，在贝特洛从煤焦油中分离出以前，在1866年从乙炔（acetylene）和萘（naphtalene）就合成了苊，命名为acetylonaphthalene，把乙炔和萘的两个名称连接在一起，后来把这一词简化成acenaphthene。苊是制造塑料、杀虫剂、杀菌剂的原料。

菲（phenanthrene，C14H10）是蒽的同分异构体，即与蒽具有相同的分子式，但结构式不同，是两种不同的化学物质。它在1873年前后分别由德国化学家菲蒂希（Rudolf Fittig，1835-1910）和奥斯特迈尔（E．Ostermeyer）以及格雷伯和格拉泽（Carl Andreas Glaser，1841-1935）分别从煤焦油所得的粗蒽中分离出来的，是有光泽的无色晶体，命名是由phenyl（苯基）和anthracene（蒽）构成。菲是制造染料炸药和药物的原料。

茚（indene，C9H8）是在1890年由德国化学家克拉默（G．Kr?mer）和斯皮克（A．Spiker）从煤焦油中分离出来的，最初没有认清它，直到1906年德国化学家蒂勒（F．K．Johannes Thiele，1865-1918）合成了茚，确定它是一种稠环芳香族碳氢化合物。茚是一种无色液体，用作油漆的溶剂。命名因其分子结构（图27-1）与吲哚（indole）相似而得名。

从煤焦油分离出来的杂环化合物还有吖啶、咔唑、噻吩、吲哚。

吖啶（cridine，C13H9N）又名氮杂蒽，这个“杂”字一般可略去，就称为氮蒽，是在1870年格雷伯和卡罗（Heinrich Caro，1834-1911）从煤焦油提取的粗蒽中发现的。它是一种无色结晶体，蒸气和溶液都有刺激气味，因而其命名来自拉丁文acr（刺激性的），再加上它类似吡啶（pyridine），就添加了-idine词尾。吖啶是制造染料的原料。

咔唑（carbazole，C12H9N）又名氮杂芴，1872年也是格雷伯和格拉泽从煤焦油提取的粗蒽中发现的，也是无色结晶体。它的命名表明了它的分子组成，是由hydrogen（氢）、carb（on）（碳）加azo（t）（氮，azot是氮气的法文名称）构成的，再加-ol词尾，表明和pyrrol（吡咯）相似。咔唑也是制染料的原料。

噻吩（thiophene，C4H4S）又名硫杂茂，是1882年德国化学家维克多?迈尔（Victor Meyer，1848-1893）从煤焦油中提取的粗苯中发现的一种含硫的杂环化合物。它是无色液体，命名来自希腊文thio（硫）和phene（苯）。噻吩是制造染料、药物的原料。

吲哚（indole，C8H7N）又名氮杂茚。它除存在于煤焦油中外，还存在于一些花的香精油中。吲哚是一种无色晶体，纯品稀释后具有新鲜的花香味，是制造靛蓝（indigo）的原料，因而得名。

什么是基因突变

发光剂是指在发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，根据上述发光特点可将发光剂分为荧光素、生物发光剂和化学发光剂三种。常用的化学发光剂有以三种，酶促反应的发光底物的发光剂，直接化学发光剂，电化学发光剂。

基因突变

基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化，亦称点突变。在自然条件下发生的突变叫自发突变，由人工利用物理因素或化学药剂诱发的突变叫诱发突变。基因突变是生物变异的主要原因，是生物进化的主要因素。在生产上人工诱变是产生生物新品种的重要方法。

根据基因结构的改变方式，基因突变可分为碱基置换突变和移码突变两种类型。

碱基置换突变：由一个错误的碱基对替代一个正确的碱基对的突变叫碱基置换突变。例如在DNA分子中的GC碱基对由CG或AT或TA所代替，AT碱基对由TA或GC或CG所代替。碱基替换过程只改变被替换碱基的那个密码子，也就是说每一次碱基替换只改变一个密码子，不会涉及到其他的密码子。引起碱基置换突变的原因和途径有两个。一是碱基类似物的掺入，例如在大肠杆菌培养基中加入5-溴尿嘧院（BU）后，会使DNA的一部分胸腺嘧啶被BU所取代，从而导致AT碱基对变成GC碱基对，或者GC碱基对变成AT碱基对。二是某些化学物质如亚硝酸、亚硝基胍、硫酸二乙酯和氮芥等，以及紫外线照射，也能引起碱基置换突变。

移码突变：基因中插入或者缺失一个或几个碱基对，会使DNA的阅读框架（读码框）发生改变，导致插入或缺失部位之后的所有密码子都跟着发生变化，结果产生一种异常的多肽链。移码突变诱发的原因是一些像吖啶类染料分子能插入DNA分子，使DNA复制时发生差错，导致移码突变。

根据遗传信息的改变方式，基因突变又可以分为同义突变、错义突变和无义突变三种类型。

同义突变：有时DNA的一个碱基对的改变并不会影响它所编码的蛋白质的氨基酸序列，这是因为改变后的密码子和改变前的密码子是简并密码子，它们编码同一种氨基酸，这种基因突变称为同义突变。

错义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变为决定另一种氨基酸的密码子的基因突变叫错义突变。这种基因突变有可能使它所编码的蛋白质部分或完全失活，例如人血红蛋白β链的基因如果将决定第6位氨基酸（谷氨酸）的密码子由CTT变为CAT，就会使它合成出的β链多肽的第6位氨基酸由谷氨酸变为缬氨酸，从而引起镰刀形细胞贫血病。

无义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变。其中密码子改变为UAG的无义突变又叫琥珀突变，密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变

分子遗传学中，营养缺陷型是指通过诱变而使得一些营养物质（如氨基酸）的合成能力出现缺陷，必须在基本培养基（如由葡萄糖和无机盐组成的培养基）中加入相应的有机成分才能正常生长的突变菌株或突变细胞。例如，野生型大肠杆菌在基本培基中能够正常生长，而组氨酸缺陷型的大肠杆菌（记为His-）只有在基本培养基中加入适量的组氨酸时才能正常生长。突变型基因转变成野生型基因的过程叫回复突变。例如把大量的His-大肠杆菌细胞接种在不含组氨酸的基本培养基中，会有极少量的细胞能够生长，出现这种情况的原因主要是这些细胞的组氨酸缺陷基因已回复为正常基因（记为His+）。

某一突变基因的表型效应由于第二个突变基因的出现而恢复正常时，称后一突变基因为前者的抑制基因。抑制基因并没有改变突变基因的DNA结构，而只是使突变型的表型恢复正常。例如，酪氨酸的密码子是UAC，置换突变使UAC变为无义密码子UAG后翻译便到此停止。如果酪氨酸tR－NA基因发生突变，使它的反密码子由 AUG变为 AUC时，其tRNA仍然能与酪氨酸结合，而且它的反密码子AUC也能与突变的无义密码子UAG配对。因此这一突变型tRNA，能使无义突变密码子位置上照常出现酪氨酸，而使翻译正常进行。这里酪氨酸tRNA的突变基因便是前一个无义突变的抑制基因。

基因突变的特点

基因突变作为生物变异的一个重要来源，它具有以下主要特点：

第一，基因突变在生物界中是普遍存在的。无论是低等生物，还是高等的动植物以及人，都可能发生基因突变。基因突变在自然界的物种中广泛存在。例如，棉花的短果枝、水稻的矮杆、糯性，果蝇的白眼、残翅，家鸽羽毛的灰红色，以及人的色肓、糖尿病、白化病等遗传病，都是突变性状。自然条件下发生的基因突变叫做自然突变，人为条件下诱发产生的基因突变叫做诱发突变。

第二，基因突变是随机发生的。它可以发生在生物个体发育的任何时期和生物体的任何细胞。一般来说，在生物个体发育的过程中，基因突变发生的时期越迟，生物体表现突变的部分就越少。例如，植物的叶芽如果在发育的早期发生基因突变，那么由这个叶芽长成的枝条，上面着生的叶、花和果实都有可能与其他枝条不同。如果基因突变发生在花芽分化时，那么，将来可能只在一朵花或一个花序上表现出变异。

基因突变可以发生在体细胞中，也可以发生在生殖细胞中。发生在生殖细胞中的突变，可以通过受精作用直接传递给后代。发生在体细胞中的突变，一般是不能传递给后代的。

第三，在自然状态下，对一种生物来说，基因突变的频率是很低的。据估计，在高等生物中，大约十万个到一亿个生殖细胞中，才会有一个生殖细胞发生基因突变，突变率是105～108。不同生物的基因突变率是不同的。例如，细菌和噬菌体等微生物的突变率比高等动值物的要低。同一种生物的不同基因，突变率也不相同。例如，玉米的抑制色素形成的基因的突变率为1.06×10-4，而**胚乳基因的突变率为2.2×10-6.

第四，大多数基因突变对生物体是有害的，由于任何一种生物都是长期进化过程的产物，它们与环境条件已经取得了高度的协调。如果发生基因突变，就有可能破坏这种协调关系。因此，基因突变对于生物的生存往往是有害的。例如，绝大多数的人类遗传病，就是由基因突变造成的，这些病对人类健康构成了严重威胁。又如，植物中常见的白化苗，也是基因突变形成的。这种苗由于缺乏叶绿素，不能进行光合作用制造有机物，最终导致亡。但是，也有少数基因突变是有利的。例如，植物的抗病性突变、耐旱性突变、微生物的抗药性突变等，都是有利于生物生存的。

第五，基因突变是不定向的。一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因。例如，控制小鼠毛色的灰色基因（A+）可以突变成**基因（AY）。也可以突变成黑色基因（a）.但是每一个基因的突变，都不是没有任何限制的。例如，小鼠毛色基因的突变，只限定在色素的范围内，不会超出这个范围。

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基因突变

科技名词定义中文名称：基因突变 英文名称：gene mutation 定义：由于核酸序列发生变化，包括缺失突变、定点突变、移框突变等，使之不再是原有基因的现象。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；基因表达与调控（二级学科）

基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。于是后代的表现中也就突然地出现祖先从未有的新性状。

基因突变（gene mutation）是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或替换，而引起的基因结构的改变，就叫做基因突变。1个基因内部可以遗传的结构的改变。又称为点突变，通常可引起一定的表型变化。广义的突变包括染色体畸变。狭义的突变专指点突变。实际上畸变和点突变的界限并不明确，特别是微细的畸变更是如此。野生型基因通过突变成为突变型基因。突变型一词既指突变基因，也指具有这一突变基因的个体。

基因突变通常发生在DNA复制时期，即细胞分裂间期，包括有丝分裂间期和减数分裂间期；同时基因突变和脱氧核糖核酸的复制、DNA损伤修复、癌变和衰老都有关系，基因突变也是生物进化的重要因素之一，所以研究基因突变除了本身的理论意义以外还有广泛的生物学意义。基因突变为遗传学研究提供突变型，为育种工作提供素材，所以它还有科学研究和生产上的实际意义。

基因突变首先由T.H.摩尔根于1910年在果蝇中发现。H.J.马勒于1927年、L.J.斯塔德勒于1928年分别用X射线等在果蝇、玉米中最先诱发了突变。1947年C.奥尔巴克首次使用了化学诱变剂，用氮芥诱发了果蝇的突变。1943年S.E.卢里亚和M.德尔布吕克最早在大肠杆菌中证明对噬菌体抗性的出现是基因突变的结果。接着在细菌对于链霉素和磺胺药的抗性方面获得同样的结论。于是基因突变这一生物界的普遍现象逐渐被充分认识，基因突变的研究也进入了新的时期。1949年光复活作用发现后，DNA损伤修复的研究也迅速推进。这些研究结果说明基因突变并不是一个单纯的化学变化，而是一个和一系列酶的作用有关的复杂过程。

1958年S.本泽发现噬菌体T4的rⅡ基因中有特别容易发生突变的位点──热点，指出一个基因的某一对核苷酸的改变和它所处的位置有关。

1959年E.佛里兹提出基因突变的碱基置换理论，1961年F.H.C.克里克等提出移码突变理论（见遗传密码）。随着分子遗传学的发展和DNA核苷酸顺序分析等技术的出现，现在已能确定基因突变所带来的DNA分子结构改变的类型，包括某些热点的分子结构，并已经能够进行定向诱变。

不论是真核生物还是原核生物的突变，也不论是什么类型的突变，都具有随机性、低频性和可逆性等共同的特性。

普遍性

基因突变在自然界各物种中普遍存在。

随机性

T.H.摩尔根在饲养的许多红色复眼的果蝇中偶然发现了一只白色复眼的果蝇。这一事实说明基因突变的发生在时间上、在发生这一突变的个体上、在发生突变的基因上，都是随机的。以后在高等植物中所发现的无数突变都说明基因突变的随机性。在细菌中则情况远为复杂。在含有某一种药物的培养基中培养细菌时往往可以得到对于这一药物具有抗性的细菌，因此曾经认为细菌的抗药性的产生是药物引起的，是定向的适应而不是随机的突变。S.卢里亚和M.德尔布吕克在1943年首先用波动测验方法证明在大肠杆菌中的抗噬菌体细菌的出现和噬菌体的存在无关。J.莱德伯格等在1952年又用印影接种方法证实了这一论点。方法是把大量对于药物敏感的细菌涂在不含药物的培养基表面，把这上面生长起来的菌落用一块灭菌的丝绒作为接种工具印影接种到含有某种药物的培养基表面，使得两个培养皿上的菌落的位置都一一对应。根据后一培养基表面生长的个别菌落的位置，可以在前一培养皿上找到相对应的菌落。在许多情况下可以看到这些菌落具有抗药性。由于前一培养基是不含药的，因此这一实验结果非常直观地说明抗药性的出现不依赖于药物的存在，而是随机突变的结果，只不过是通过药物将它们检出而已。

稀有性

在第一个突变基因发现时，不是发现若干白色复眼果绳而是只发现一只，说明突变是极为稀有的，也就是说野生型基因以极低的突变率发生突变（一些有代表性的基因突变率见表）。在有性生殖的生物中，突变率用每一配子发生突变的概率，也就是用一定数目配子中的突变型配子数表示。在无性生殖的细菌中，突变率用每一细胞世代中每一细菌发生突变的概率，也就是用一定数目的细菌在分裂一次过程中发生突变的次数表示。据估计，在高等生物中，大约10^5~10^8个生殖细胞中，才会有1个生殖细胞发生基因突变。虽然基因突变的频率很低，但是当一个种群内有许多个体时，就有可能产生各种各样的随机突变，足以提供丰富的可遗传的变异。

可逆性

野生型基因经过突变成为突变型基因的过程称为正向突变。正向突变的稀有性说明野生型基因是一个比较稳定的结构。突变基因又可以通过突变而成为野生型基因，这一过程称为回复突变。从表中同样可以看到回复突变是难得发生的，说明突变基因也是一个比较稳定的结构。不过，正向突变率总是高于回复突变率，这是因为一个野生型基因内部的许多位置上的结构改变都可以导致基因突变，但是一个突变基因内部只有一个位置上的结构改变才能使它恢复原状。

少利多害性

一般基因突变会产生不利的影响，被淘汰或是亡，但有极少数会使物种增强适应性。

不定向性

例如控制黑毛A基因可能突变为控制白毛的a+或控制绿毛的a-基因。

有益性

一般基因突变是有害的，但是有极为少数的是有益突变。例如一只鸟的嘴巴很短，突然突变变种后，嘴巴会变长，这样会容易捕捉食物或水。

一般，基因突变后身体会发出抗体或其他修复体进行自行修复。可是有一些突变是不可回转性的。突变可能导致立即亡，也可以导致惨重后果，如器官无法正常运作，DNA严重受损，身体免疫力低下等。如果是有益突变，可能会发生奇迹，如身体分泌中特殊变种细胞来保护器官，身体，或在一些没有受骨骼保护的部位长出骨骼。基因与DNA就像是每个人的身份证，可他又是一个人的先知，因为它决定着身体的衰老、病变、亡的时间。

独立性

某一基因位点的一个等位基因发生突变，不影响另一个等位基因，即等位基因中的两个基因不会同时发生突变。

①隐性突变：当代不表现，F2代表现。

②显性突变：当代表现，与原性状并存，形成镶嵌现象或嵌合体。

重演性

同一生物不同个体之间可以多次发生同样的突变。

种类

基因突变可以是自发的也可以是诱发的。自发产生的基因突变型和诱发产生的基因突变型之间没有本质上的不同，基因突变诱变剂的作用也只是提高了基因的突变率。

按照表型效应，突变型可以区分为形态突变型、生化突变型以及致突变型等。这样的区分并不涉及突变的本质，而且也不严格。因为形态的突变和致的突变必然有它们的生物化学基础，所以严格地讲一切突变型都是生物化学突变型。

根据碱基变化的情况，基因突变一般可分为碱基置换突变（base substitution和移码突变（frameshift mutation）两大类。

碱基置换突变

指DNA分子中一个碱基对被另一个不同的碱基对取代所引起的突变，也称为点突变（point mutation）。点突变分转换和颠换两种形式。如果一种嘌呤被另一种嘌呤取代或一种嘧啶被另一种嘧啶取代则称为转换（transition）。嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤的突变则称为颠换（transversion）。由于DNA分子中有四种碱基，故可能出现4种转换和8种颠换（见上图）。在自然发生的突变中，转换多于颠换。

碱基对的转换可由碱基类似物的掺入造成。例如，5-溴尿嘧啶(5-bromouracil，BU）是一种与胸腺嘧啶类似的化合物，具有酮式和烯醇式两种结构，且两者可以互变，一般酮式较易变为烯醇式。当DNA复制

时，酮式BU代替了T，使A-T碱基对变为A-BU；第二次复制时，烯醇式BU能和G配对，故出现G-BU碱基对；第三次复制时，G和C配对，从而出现G-C碱基对，这样，原来的A-T碱基对就变成G-C碱基对（见左图）。

碱基对的转换也可由一些化学诱变剂诱变所致。例如，亚硝酸类能使胞嘧啶（C）氧化脱氨变成尿嘧啶（U），在下一

次复制中，U不与G配对，而与A配对；复制结果C-G变为T-A（见右图）。又如，烷化剂中的芥子气和硫酸二乙酯可使G发生乙基化，成为烷基化鸟嘌呤（mG），结果，mG不与C配对，而与T配对，经过复制，G-C变为A-T。

移码突变

指DNA片段中某一位点插入或丢失一个或几个（非3或3的倍数）碱基对时，造成插入或丢失位点以后的一系列编码顺序发生错位的一种突变。它可引起该位点以后的遗传信息都出现异常。发生了移码突变的基因在表达时可使组成多肽链的氨基酸序列发生改变，从而严重影响蛋白质或酶的结构与功能。吖啶类诱变剂如原黄素、吖黄素、吖啶橙等由于分子比较扁平，能插入到DNA分子的相邻碱基对之间。如在DNA复制前插入，会造成1个碱基对的插入；若在复制过程中插入，则会造成1个碱基对的缺失，两者的结果都引起移码突变。

缺失突变

基因也可以因为较长片段的DNA的缺失而发生突变。缺失的范围如果包括两个基因，那么就好象两个基因同时发生突变，因此又称为多位点突变。由缺失造成的突变不会发生回复突变。所以严格地讲，缺失应属于染色体畸变。

插入突变

一个基因的DNA中如果插入一段外来的DNA，那么它的结构便被破坏而导致突变。大肠杆菌的噬菌体Mu-1和一些插入顺序（IS）以及转座子（见转座因子）都是能够转移位置的遗传因子，当它们转移到某一基因中时，便使这一基因发生突变。许多转座子上带有抗药性基因，当它们转移到某一基因中时，一方面引起突变，另一方面使这一位置上出现一个抗药性基因。插入的DNA分子可以通过切离而失去，准确的切离可以使突变基因回复成为野生型基因。这一事件的出现频率并不由于诱变剂的处理而提高。

影响同义突变

无论是碱基置换突变还是移码突变，都能使多肽链中氨基酸组成或顺序发生改变，进而影响蛋白质或酶的生物功能，使机体的表型出现异常。碱基突变对多肽链中氨基酸序列的影响一般有下列几种类型。

⑴同义突变（same sense mutation）：碱基置换后，虽然每个密码子变成了另一个密码子，但由于密码子的简并性，因而改变前、后密码子所编码的氨基酸不变，故实际上不会发生突变效应。例如，DNA分子模板链中GCG的第三位G被A取代，变为GCA，则mRNA中相应的密码子CGC就变为CGU，由于CGC和CGU都是编码精氨酸的密码子，故突变前后的基因产物（蛋白质）完全相同。同义突变约占碱基置换突变总数的25﹪。

错义突变

错义突变（missense mutation）：碱基对的置换使mRNA的某一个密码子变成编码另一种氨基酸的密码子的突变称为错义突变。错义突变可导致机体内某种蛋白质或酶在结构及功能发生异常，从而引起疾病。如人类正常血红蛋白β链的第六位是谷氨酸，其密码子为GAA或GAG，如果第二个碱基A被U替代，就变成GUA或GUG，谷氨酸则被缬氨酸所替代，形成异常血红蛋白HbS，导致个体产生镰形细胞贫血，产生了突变效应。

无义突变

无义突变（nonsense mutation）：某个编码氨基酸的密码突变为终止密码，多肽链合成提前终止，产生没有生物活性的多肽片段，称为无义突变。例如，DNA分子中的ATG中的G被T取代时，相应mRNA链上的密码子便从UAC变为UAA，因而使翻译就此停止，造成肽链缩短。这种突变在多数情况下会影响蛋白质或酶的功能。

终止密码

终止密码突变（terminator codon mutation）：基因中一个终止密码突变为编码某个氨基酸的密码子的突变称为终止密码突变。由于肽链合成直到下一个终止密码出现才停止，因而合成了过长的多肽链，故也称为延长突变。例如，人血红蛋白α链突变型Hb Constant Spring比正常人α珠蛋白链多了31个氨基酸。

影响因素外因

物理因素：x射线、激光、紫外线、伽马射线等。

化学因素：亚硝酸、黄曲霉素、碱基类似物等。

生物因素：某些病毒和细菌等。

内因

DNA复制过程中，基因内部的脱氧核苷酸的数量、顺序、种类发生了局部改变从而改变了遗传信息

编辑本段应用

对于人类来讲，基因突变可以是有用的也可以是有害的。

诱变育种

通过诱发使生物产生大量而多样的基因突变，从而可以根据需要选育出优良品种，这是基因突变的有用的方面。在化学诱变剂发现以前，植物育种工作主要采用辐射作为诱变剂；化学诱变剂发现以后，诱变手段便大大地增加了。在微生物的诱变育种工作中，由于容易在短时间中处理大量的个体，所以一般只是要求诱变剂作用强，也就是说要求它能产生大量的突变。对于难以在短时间内处理大量个体的高等植物来讲，则要求诱变剂的作用较强，效率较高并较为专一。所谓效率较高便是产生更多的基因突变和较少的染色体畸变。所谓专一便是产生特定类型的突变型。以色列培育“彩色青椒”关键技术就是把青椒种子送上太空，使其在完全失重状态下发生基因突变来育种。

害虫防治

用诱变剂处理雄性害虫使之发生致的或条件致的突变，然后释放这些雄性害虫，便能使它们和野生的雄性昆虫相竞争而产生致

的或不育的子代。

诱变物质的检测

多数突变对于生物本身来讲是有害的，人类的癌症的发生也和基因突变有密切的关系，因此环境中的诱变物质的检测已成为公共卫生的一项重要任务。

检测方法

从基因突变的性质来看，检测方法分为显性突变法、隐性突变法和回复突变法三类。①显性致突变法，用待测物质处理雄性小鼠，使处理的雄鼠和未处理的雌鼠交配，观察母鼠子宫中的胎数，胎数愈多则说明诱发的显性致突变愈多。这一方法适用于慢性处理，其优点是可靠性较大，而且测试对象是哺乳动物。缺点是不能区别出药物对遗传物质的诱变作用和对于胚胎发育的其他毒理效应。②隐性突变法，一般采用某些隐性突变基因呈杂合状态的动植物作为测试对象，如果经某种药物处理后出现这一隐性性状，便说明这一药物诱发了这一隐性突变。小鼠中有多个隐性突变基因呈杂合状态的品系，可以用它来同时测定几个座位上诱发的基因突变。这一方法的优点是所测得的是哺乳动物中的基因突变，缺点是灵敏度较低，而且必须具备特殊的动植物品系，实验周期也较长。CIB法是用果蝇作为测试对象的一种检测方法。主要用来检测X染色体上发生的隐性致突变。果蝇的生活周期较短，所以这一方法的实验周期也较短。③回复突变法，一种根据回复突变诱发频率检测诱变物质的方法，由B.艾姆斯在1973年所首创，又称艾姆斯测验。测试对象是鼠伤寒沙门氏菌的几个组氨酸缺陷型菌株，包括碱基置换突变型和移码突变型。在检测系统中还包括大鼠的肝脏微粒体活化系统(S9），其中的酶能使一些前诱变剂转变为诱变剂。虽然在这里测试对象是细菌，而不是哺乳动物，但是由于这一检测系统简便易行，灵敏度较高，所以常用来作为诱变物质检测初步筛选的短期测试系统，用这种方法已经对几百种物质进行了测试，发现大约90%的致癌物质具有诱变作用。④中间宿主扩散盒法，为了能使回复突变法更接近于哺乳动物活体中的情况，有人把测试的细胞放在一种特制的小盒中，小盒的膜只允许溶液通过。把这种小盒埋藏在动物腹腔内，用待测物质处理动物，经过一定的时间后把小盒取出，测定小盒中被诱发回复突变的细胞数。

除了用来检测基因突变的许多方法以外，还有许多用来检测染色体畸变和姐妹染色单体互换的测试系统。当然对于药物的致癌活性的最可靠的测定是哺乳动物体内致癌情况的检测。但是利用微生物中诱发回复突变这一指标作为致癌物质的初步筛选，仍具有重要的实际意义（见毒理遗传学）。

诱发机制碱基置换突变

可以通过两个途径即碱基结构类似物的参入和诱变剂或射线引起的化学变化来进行。

①　类似物的参入　5-溴尿嘧啶(BU）是胸腺嘧啶的结构类似物。它只是在第5位碳原子上以溴原子代替了胸腺嘧啶的甲基（─GH3），并且因此更易以烯醇式出现（图2）。基因突变

大肠杆菌在含有BU的培养基中培养后，细菌的 DNA中的一部分胸腺嘧啶被BU所取代，并且最后在培养物中可以发现有少数突变型细菌出现，取代BU的量愈大则突变型愈多。突变型细菌在不含有BU的培养基中长久培养时，不改变它的突变型性状，可是把突变型细菌在含有BU的培养基中培养后，又可以发现少数由于发生回复突变而出现的野生型细菌。BU的诱变作用可以表示。首先在DNA复制过程中酮式的BU代替了胸腺嘧啶T而使A:T碱基对变为A:BU，在下一次DNA复制中烯醇式的BU*和鸟嘌呤G配对而出现G∶BU碱基对，最后在又一次复制中鸟嘌呤G和胞嘧啶C配对而终于出现G:C碱基对，完成了碱基的置换。这里BU所起的作用是促成这一置换，起促成作用的原因是由于嘧啶的 5位上溴原子代替了甲基后便较多地出现烯醇式的嘧啶。

同一理论还可以用来说明 BU是怎样诱发 的置换突变或者突变型的回复突变（图4)

2-氨基嘌呤等其他碱基结构类似物同样具有诱变作用。

②药物或射线引起的化学变化　亚硝酸能够作用于腺嘌呤(A）的氨基而使它变为次黄嘌呤(HX）；可以作用于胞嘧啶（c）而使它变为尿嘧啶（U）。这两种氨基到酮基的变化带来碱基配对关系的改变，从而通过 DNA复制而造成A∶T→G∶C或者 G∶C→A∶T置换。

羟胺只和胞嘧啶发生专一性的反应，所以它几乎只诱发置换而不诱发置换。此外，pH值低或高温都可以促使DNA分子失去碱基特别是嘌呤，导致碱基置换。

紫外线的照射使 DNA分子上邻接的碱基形成二聚体，主要是胸腺嘧啶二聚体T-T。二聚体的形成使DNA双链呈现不正常的构型（见DNA损伤修复），从而带来致效应或者导致基因突变，其中包括多种类型的碱基置换。

移码突变

诱发移码突变的诱变剂种类较少，主要是吖啶类染料（图6）。这些染料分子能够嵌入DNA分子中，从而使DNA复制发生差错而造成移码突变。

定向诱变

利用重组DNA技术使DNA分子在指定位置上发生特定的变化，从而收到定向的诱变效果。例如将DNA分子用某一种限制性核酸内切酶处理，再用分解DNA单链的核酸酶S1处理，以去除两个粘性末端的单链部分，然后用噬菌体T4连接酶将两个平头末端连接起来，这样就可得到缺失了相应于这一限制性内切酶的识别位点的几个核苷酸的突变型。相反地，如果在四种脱氧核苷三磷酸(dNTP）存在的情况下加入 DNA多聚酶Ⅰ，那么进行互补合成的结果就得到多了相应几个核苷酸的两个平头末端。在T4接连酶的处理下，便可以在同一位置上得到几个核苷酸发生重复的突变型。

在指定的位置上也可以定向地诱发置换突变。诱变剂亚硫酸氢钠能够使胞嘧啶脱氨基而成为尿嘧啶，但是这种作用只限于 DNA单链上的胞嘧啶而对于双链上的胞嘧啶则无效。用识别位点中包含一个胞嘧啶的限制性内切酶处理DNA分子，使粘性末端中的胞嘧啶得以暴露（例如HindⅢ的识别位点是，经限制酶HindⅢ处理后得到粘性末端，中间的这一胞嘧啶便暴露了）。经亚硫酸氢钠处理后胞嘧啶（c）变为尿嘧啶（U)。通过DNA复制原来的碱基对C∶G便转变成为 T∶A。这样一个指定位置的碱基置换突变便被诱发。

还可以把人工合成的低聚核苷酸片段引入基因组中，以一定的方式改变某一基因等。

自发突变

所谓自发突变是指未经诱变剂处理而出现的突变。从诱变机制的研究结果来看，自发突变的原因不外乎以下几种。①背景辐射和环境诱变。短波辐射在宇宙中随时都有，实验说明辐射的诱变作用不存在阈效应，即任何微弱剂量的辐射都具有某种程度的诱变作用，因此自发突变中可能有一小部分是短波辐射所诱发的突变，有人估计果蝇的这部分突变约占自发突变的 0.1%。此外，接触环境中的诱变物质也是自发突变的一个原因。②生物自身所产生的诱变物质的作用。过氧化氢是一种诱变剂。在用过氧化氢作诱变处理时加入过氧化氢酶可以降低诱变作用，如果同时再加入氰化钾(KCN）则诱变作用又重新提高。这是因为KCN是过氧化氢酶的抑制剂。另外又发现在未经诱变处理的细胞群体中加入KCN时，可以提高自发突变率，说明细胞自身所产生的过氧化氢是一部分自发突变的原因。在一些高等植物和微生物中曾经发现一些具有诱变作用的物质，在长久储藏的洋葱和烟草等种子中也曾经得到具有诱变作用的抽提物。③碱基的异构互变效应。天然碱基结构类似物5-溴尿嘧啶所以能诱发碱基置换突变，是因为5位（图2）上的溴原子促使BU较多地以烯醇式结构出现。在正常的情况下酮式和烯醇式之间的异构互变也以极低的频率发生着，它必然同样地造成一部分并不起源于环境因素的自发突变。此外，推测氨基和亚氨基之间的异构互变同样是自发突变的一个原因。严格地讲，这才是真正的自发突变。核苷酸还可以有其他形式的异构互变，它们同样可能是自发突变的原因。

影响因素内在因素

突变是一系列变化的结果。影响这一系列变化的任何一个环节的因素都会对于突变型的出现有一定的影响。

诱变剂接触 DNA以前必须首先进入细胞，才能诱发突变。高等植物对于紫外线的诱变作用较不敏感的原因就是因为紫外线不易穿透它的细胞壁。化学药品的渗透和细胞膜的结构有很大的关系。鼠伤寒沙门氏菌有一个改变细胞膜成分的突变型深度粗糙 (rfa），它使细胞膜对于许多药物的渗透性增大，从而提高了细胞对许多化学诱变剂的敏感性。

细胞中的酶可以破坏进入细胞的诱变剂，从而减弱诱变效果。例如，过氧化氢酶可以减弱过氧化氢的诱变效果。一些没有诱变作用的物质也可以因为细胞中的酶的活化作用而使该物质转变成为诱变剂，这些物质称为前诱变剂。例如陆蒽酮本身没有诱变作用，但可以通过肝脏中的羟化酶的作用而转变为诱变剂海蒽酮（图7）。

基因突变

诱变剂接触DNA以后，能使DNA发生局部的损伤，这些损伤如果未经修复，便可阻碍 DNA的复制而造成细胞亡。修复 DNA损伤的机制有两类：一类称为无误修复，它使 DNA恢复原状但不带来突变；另一类称为易误修复或称错误倾向修复，它使DNA复制继续进行，但也常同时带来基因突变。

细胞中有关 DNA损伤修复的酶活性的改变，可以改变细胞对于诱变剂的杀伤作用或诱变作用的反应。由于基因突变而使不论哪一种有关 DNA损伤修复的酶失活时，都必然导致细胞对于紫外线或其他诱变剂的杀伤作用变得更为敏感。可是就诱变结果来讲，则要看这酶是涉及无误修复，还是易误修复。如果属于前者，那么有关的基因发生突变时将使突变更易发生，如果属于后者，那么有关的基因发生突变时将使突变更不易发生，因此这些突变型分别称为增变基因和抗变基因。在大肠杆菌噬菌体T4中，基因43编码 DNA多聚酶。基因43的突变型有两种。一种是增变基因，它的 DNA多聚酶的核酸外切酶活性和多聚酶活性之比小于野生型的 DNA多聚酶；另一种是抗变基因，它的 DNA多聚酶的这两种活性比大于野生型的 DNA多聚酶。在其他生物如大肠杆菌、酵母菌和一些真核生物中也曾发现增变基因。

外界因素

①　温度，基因突变包括一系列生物化学变化，所以温度对于基因突变有一定的影响。在大肠杆菌中，组氨酸缺陷型（his-）在15℃到37℃范围内温度每升高 10℃自发回复突变率提高1～1.5倍，在0℃时不发生自发突变。果蝇的致突变的温度系数也在这范围内。在微生物和果蝇中，较短时间的温度改变，特别是不适宜于生存的较高温度的处理，都可以诱发突变；在果蝇中还有-6℃低温处理诱发突变的报道。②培养基成分，SOS是一种经诱导后才出现的易误修复机制。和诱导酶的合成一样，蛋白质合成是使细菌细胞中出现SOS机制的必要因素，所以培养基中一切影响蛋白质合成的因素都会影响基因突变。③抗变剂和助变剂，能够促进另一诱变剂的作用的物质称为助变剂。例如，色氨酸烧焦后产生两种诱变剂和助变剂。

已经知道亚硝基胍(NTC）是一种高效诱变剂。在一定条件下，NTG的诱变效果能被氯化钴和活体红细胞中的含硫化合物减低，说明氯化钴和红细胞中存在着的某种物质具有抗变作用。这些能够降低自发或诱发突变率的物质称为抗变剂。此外，某些多肽如白肽素等也都被证明是抗变剂。

详见复制DNA 的作用是什么

酶促反应的发光底物

酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物，目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。HRP的发光底物为鲁米诺或其衍生物和对-羟基苯乙酸。AP的发光底物为3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物）。

（1）.鲁米诺或其衍生物。 鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.1mol/L pH8.6Tris缓冲液作底物液。要注意是:首先,鲁米诺和H2O2在无HRP催化时也能缓慢自发发光，而在最后光强度测定中造成空白干扰，因而宜分别配制成2瓶试剂溶液，只在用前即刻混合;其次, HRP发光增强剂如某些酚试剂（如邻－碘酚）或萤火虫荧光素酶可增强HRP催化鲁米诺氧化的反应和延长发光时间，提高发光敏感度。

（2）.对-羟基苯乙酸（HPA)。 对-羟基苯乙酸（HPA）在H2O2存在下被HRP氧化或氧化二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光，可用荧光光度计测量。

（3）.AMPPD。 AMPPD在碱性条件下，被ALP酶解生成相当稳定的AMP-D阴离子，其有2-30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度达到高峰，15-60min内光强度保持相对稳定。

（4）4-MUP。 4-MUP被ALP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的激发光的作用下，发出448nm的荧光，用荧光光度计进行测量。

直接化学发光剂

直接化学发光剂不需酶的催化作用，只需改变溶液的pH等条件就能发光的物质，如吖啶酯（acridinium, AE）在有过氧化氢的稀碱溶液中即能发光。

电化学发光剂

电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+（图16-7）和电子供体三丙胺（TPA）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，成为强氧化剂，TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+，它很不稳定，可自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA.，成为一种很强的还原剂，可将一个高能量的电子递给三价的[Ru(bpy)3]3+使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+.。激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出一个波长为620nm的光子，回复到基态的三联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强。

三、RNA引物

目前所发现的DNA聚合酶都需要一个具3′-OH的引物，才能将合成原料dNTP一个一个接上去。因为DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP在DNA模板上进行聚合，如图12-3所示。实验又发现抑制RNA聚合酶的药物如利福霉素(rifampicin)能抑制DNA的复制。再者在体外DNA复制实验中发现冈崎片段的5′端都有一小段4~12个核苷酸的RNA引物(RNA primer)。现知RNA聚合酶合成新链时不需要引物，能直接催化游离NTP聚合。可见RNA引物为DNA聚合酶提供聚合新核苷酸所需的3′-OH。RNA引物最后被DNA聚合酶Ⅰ除去，留下的空隙也由该酶补满，缺口再由DNA连接酶封口。

在DNA的复制需要RNA引物呢，除了DNA聚合酶不能催化两个游离dNTP的聚合，而RNA引物酶却具有此能力外，这种作用尚可尽量减少DNA复制起始处的突变。因为游离核苷酸起始处的聚合最容易出现差错，若用RNA引物，即使出现差错，由于最后将被DNA聚合酶Ⅰ切除，便可提高DNA复制的真实性。

四、引发体

引发体(primosome)是由多种蛋白质及酶组成，是DNA复制开始所必需的。引发体中的某些蛋白质如DnaA能结合至DNA复制起始部位，DnaB具有解链酶的作用，DnaC辅助DnaB结合到复制起始点，使起始部位的双链解开。而引发体中的引物酶(primase)在已解开起始部位的DNA单链按碱基互补配对催化NTP聚合，合成一小片段的RNA，作为DNA合成的引物，即沿此引物RNA的3′-OH进行延伸。

四、真核生物端粒DNA的复制

真核生物线性染色体的两个末端称为端粒(telomere)。按上述DNA复制机制新合成子链5′端的那段RNA引物被切除后，必留下一个空缺，假如每次细胞分裂或DNA复制都是如此，端粒将会不断缩短，最终导致关键基因的丧失及种系灭绝的危险，但事实并非如此。那么真核生物一定存在着某种阻止端粒缩短的机制。

(一) 端粒DNA的结构和端粒酶

对端粒DNA序列的分析，发现端粒DNA的3′端是由数百个串联重复GT丰富的短的寡核苷酸序列，如四膜虫的重复序列为-GGGGTT-，人为-AGGGTT-。端粒DNA序列虽不含功能基因，但对维持染色体的稳定性起着重要作用。如果端粒丧失，染色体之间可能出现端-端融合、降解、重排乃至染色体丢失等变化，最后细胞衰亡。

近年来，发现了一种能防止端粒缩短的酶，称为端粒酶(telomerase)，该酶由蛋白质和RNA两部分组成，其中RNA作为合成端粒DNA的模板，端粒酶是目前所知唯一携带RNA模板的逆转录酶，具有种属特异性，例如四膜虫的端粒酶，其RNA部分含159个核苷酸，其中有一段序列为5′-CAACCCCAA-3′可作为合成端粒DNA3′端GT 丰富序列-GGGGTT-模板。人端粒酶的RNA含450个碱基，其中-CUAACCCUAAC-为合成-AGGGTT-的模板。这样可防止细胞分裂时DNA复制端粒的缩短。

端粒、端粒酶和细胞的衰老有密切关系。有人将端粒称为分子钟或有丝分裂钟。但是恶性肿瘤细胞当端粒缩短到某种程度，端粒酶活性又重新出现，对端粒进行补偿，使之永不衰亡，形成恶性增殖。

(二) 端粒酶的作用机制

第四节DNA的损伤与修复

DNA是储存遗传信息的物质。从生物遗传角度来讲，要求在复制过程中保持遗传密码的稳定性，物种才能得以延续。哺乳动物单倍体细胞的基因组由2.9X109 bp DNA组成。动物一生中，从受精卵细胞到个体亡，这些遗传密码要经过千万次的复制。在物种进化的长河中，DNA复制的次数更是难以计数，而且生物体内外环境都存在着使DNA损伤（DNA damage）的因素。可见，除DNA复制的高度真实性外，还要求某种修复DNA损伤的机制。每一遗传信息都以不同拷贝储存在DNA两条互补链上。因此，若一条链有损伤，可被修复酶切除，并以未损伤的信息重新合成与原来相同的序列，这就是DNA修复（DNA repair）的基础。

但是在漫长的进化过程中，DNA的序列还是会发生改变, 通过复制传递给子代成为永久的，这种DNA的核苷酸序列永久的改变称为突变(mutation)。若发生的突变有利于生物的生存则保留下来，这就是进化；若不适应于自然选择(nature selection)则被淘汰，因此生物的进化可以看成是一种主动的基因改变过程，这是物种多样性的原动力。所以，生物的变异是绝对的，修复是相对的。

一、造成DNA损伤的因素

造成DNA损伤的因素有生物体内自发的、亦有外界物理和化学等因素。

(一) 自发的因素

由于DNA分子受到周围环境溶剂分子的随机热碰撞(thermal collision)，腺嘌呤或鸟嘌呤与脱氧核糖间的N-糖苷键可以断裂，使A或G脱落。人体细胞中DNA每天每个细胞要脱落5 000个嘌呤碱，每天每个细胞也有100个胞嘧

啶自发脱氨而成尿嘧啶。

(二) 物理因素

1．紫外线损伤由于嘌呤环与嘧啶环都含有共轭双键，能吸收紫外线而引起损伤。嘧啶碱引起的损伤比嘌呤碱大10倍。损伤是由于嘧啶二聚体的产生，即2个相邻嘧啶碱的C5和C6共价交联，如图12-18所示。

2．电离辐射损伤如X射线和γ射线，可以是辐射能量直接对DNA的影响，或DNA周围的溶剂分子吸收了辐射能，再对DNA产生损伤作用。如碱基的破坏、单链的断裂、双链的断裂、分子间的交联、碱基脱落或核糖的破坏等。

(三) 化学因素

二、DNA损伤的类型

根据DNA分子的改变，可把突变分为下面几种主要类型。

点突变

点突变(point mutation)是DNA分子上一个碱基的变异，可分为：①转换(transition)同型碱基，如一种嘌呤代替另一种嘌呤或一种嘧啶代替另一嘧啶。②颠换(transversation)异型碱基，即嘌呤变嘧啶，或嘧啶变嘌呤。点突变可根据发生在DNA分子的部位，如发生在启动子或剪接信号部位可以影响整个基因的功能；若发生在编码序列，有的可以改变蛋白质的功能如引起镰状红细胞贫血；有的则为中性变化，即编码氨基酸虽变化，但功能不受影响；有的甚至是静止突变，碱基虽变但编码氨基酸种类不变。

缺失

缺失(deletion)是一个碱基或一段核苷酸链乃至整个基因，从DNA大分子上丢失。如有些地中海贫血、生长激素基因缺失，再如上述Lesch- Nyhan综合征是HGPRT基因缺失。

（三）插入

插入(insertion)是一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸序列插入到DNA大分子中去，或有些芳香族分子如吖啶(acridine)嵌入DNA双螺旋碱基对中，可以引起移码突变(frame-shift-mutation)，影响三联体密码的阅读方式。

（四）倒位

DNA链内部重组，使其一段方向颠倒。

三、修复机制

光修复机制

这种机制主要存在于低等生物。

1. 不需要光复活酶

光复活酶(photoreactivating enzyme)也称为DNA光修复酶(photolyase)。当280nm紫外线照射DNA产生的嘧啶二聚体，在短波239nm照射下，二聚体即分解成单体。

2. 需要光复活酶紫外线照射使光复活酶激活，能解聚嘧啶二聚体。

切除修复

因不需要光照射，故也称暗修复。DNA引起大的损伤, 包括UV引起的嘧啶二聚体、嘧啶/ 环丁烷二聚体、几个其它类型的碱基加合物、通过曝露于香烟的烟尘在DNA中形成的苯并芘尿嘧啶。一般由切除修复(excision repair)系统修复。该修复途径对所有生物的生存是关键的。在大肠杆菌E.coli中，有一种UV特异的切割酶(excinuclease或UVrABC enzyme)，能识别UV照过产生的二聚体部位。并在远离损伤部位5′端8个核苷酸处及3′端4个核苷酸处各作一切口。像外科手术“扩创”一样，将含损伤的一段DNA切掉。DNA聚合酶Ⅰ进入此缝隙，从3′-OH开始，按碱基配对原则以另一条完好链为模板进行修复。最后由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来DNA链连接而封口 (图12-19) 。真核细胞的切割核酸酶的作用和机制，是与细菌的酶完全类似的方式对嘧啶二聚体切割。切除修复是人体细胞的重要修复形式，有些遗传性疾病如着色性干皮病(xeroderma pigmentosum)，是常染色体隐性遗传性疾病。纯合子患者的皮肤对阳光或紫外线极度敏感，皮肤变干、真皮萎缩、角化、眼睑结疤、角膜溃疡，易患皮肤癌。此病是由于缺乏UV特异内切核酸酶造成的。

(三) 碱基切除修复

每个细胞都有一类DNA糖苷酶(DNA glycosylase)，每一种酶能识别一种DNA分子中改变的碱基，能水解该改变的碱基与脱氧核糖间的糖苷键，使改变的碱基脱落，在DNA上产生一个缺嘌呤或缺嘧啶的位（apurinic-or apyrimidinic-site，AP site）,再藉切除修复机制进行修复。现知至少有20种不同的DNA糖苷酶，各具特异性。如识别胞嘧啶脱氨生成的尿嘧啶，腺嘌呤脱氨基产物，开环的碱基，不同烷基化类型的碱基等。如胞嘧啶脱氨后即成尿嘧啶，若不纠正，可引起类型转换，即G-C→A-T。

碱基切除修复（base-excision repair）步骤如下：

1)DNA糖苷酶识别损伤的碱基,在碱基和脱氧核糖之间切割。

2）AP核酸内切酶切AP位置附近的磷酸二酯键。

3）DNA聚合酶Ⅰ用它的5′→3′外切酶活性除去损伤链,从缺口的3′-OH起始

修复合成,用新合成的DNA替代。

4）最后缺口由DNA连接酶封口(图12-20)。

尿嘧啶DNA糖苷酶修复的发现，解答了一个长年以来的疑题，即组成RNA是U，而组成DNA却是甲基化为T，即从UMP→dTMP，要消耗能量。但U和T都与A互补配对，所编的密码是相同的。生物体为什么花如此代价? 现在问题清楚了，尿嘧啶-DNA糖苷酶只能切除DNA链上的尿嘧啶，而不能切除DNA链上的胸腺嘧啶，因为后者C5有一甲基，好像是给尿嘧啶加上一个标签。胞嘧啶脱氨基后形成的尿嘧啶即无此标签，即被该糖苷酶识别为改变了的碱基。若DNA与RNA一样也用尿嘧啶，那么胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶，与正常部位的尿嘧啶便无法区别，不能纠正，造成子代DNA的突变即GC→AT。可见DNA由T代替U，能增加遗传信息的稳定性。相反，RNA不需修复，拷贝数很多，半衰期短，即使有个拷贝的胞嘧啶脱氨基转变为U，影响也不大，合成出来的绝大多数蛋白质还是具有正常生理功能，而且U作为合成原料经济得多。

第五节重组DNA技术

DNA重组(recombination of DNA)是自然界常见现象，指的是在两个DNA分子之间，或一个DNA分子的两个不同部位之间通过链断裂和片段的交换重接，改变了基因的组合序列。这种交换可发生于同一细胞内或细胞间，甚至不同物种的DNA。DNA重组现象广泛存在于真核细胞、原核细胞乃至病毒和质粒。

本节所要介绍的重组DNA技术或基因工程(genetic engineering)，是70年代由Stanford大学Boyer、Cohen和Berg等科学家建立的一种革命性的技术方法，它是在实验室内用人工方法将不同来源，包括不同种属生物的DNA片段，拼接成一个重组DNA(recombinant DNA)分子，将其引入活细胞内，使其大量复制或表达。这种技术方法称为重组DNA技术。由于它可以把一个生物体中携带的某一特定的遗传信息(基因)，通过一定的方法转移到另一生物体中，使之获得前者的遗传特征，创造新的遗传组合，所以又称为基因工程，若从遗传角度来考虑也可称为遗传工程。重组DNA技术中所含有的目的DNA分子或基因需进行无性繁殖、扩增成为一个克隆(clone)，因此基因工程在不同的场合又可有不同的名称，如分子克隆(molecular cloning)、DNA克隆、基因克隆等。

4．聚合酶链反应(PCR)扩增DNA片段或cDNA

以已有DNA为模板，通过PCR扩增出所需片段。另可以mRNA为模板，采用逆转录酶PCR进行扩增，得到所需要的cDNA。(详见下节)。

(二) 载体

欲将外源基因或DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达，需要通过一个能在宿主细胞中进行自我复制并表达目的基因的载体(vector)的介导，目的DNA与载体在体外构成重组DNA分子，然后导入宿主细胞，进行扩增及表达。以大肠杆菌作为宿主细胞的载体有：质粒、λ噬菌体、粘粒和M13噬菌体等。这些载体分为克隆用和表达用不同种类，有些还含有在真核细胞中生活及基因表达必须的成分，供不同实验目的选用，多数已作为商品供应。

1. 克隆载体(vector of clone)

(1)质粒质粒(plasmid)是细菌染色体外小的双链闭环的DNA分子，能自主复制，并含有抗药性基因。

较理想的质粒应符合下列条件：

1) 要有多个单切口的限制性内切酶的位点，而且外源DNA片段插入后，不影响质粒的复制。

2) 含有抗药性或其他可供筛选的标志，外源DNA插入后，抗药性消失，或其他酶活性丧失。

3) 含有高效的自主复制序列，这样在宿主细胞中质粒复制的拷贝数多。若含有能在真核细胞生活的序列，这种载体则能在真核细胞中生活及表达。pBR322是一种最常用、最基础的质粒。通过人工构建而成，其结构如图12-22所示。大小：4363bp抗药性基因：有两个。氨苄青霉素抗性 (ampicillin resistance,ampR)基因编码β-内酰胺酶(β-1actamase)，能切开氨苄青霉素的内酰胺环，从而使之失效。若在此基因中插入外源DNA片段，即破坏该酶的结构。另一四环素抗性(tetracycline resistance,ampR)基因，编码一种蛋白质，能改变细菌膜的状态，阻止四环素进入细胞而赋予宿主抗四环素的能力。若

该基因被外源DNA插入即失活。自主复制(ori)成分(序列),使pBR322在大肠杆菌内能高效进行复制，产生多拷贝。

另一些质粒如pUC系统，除含ampr基因外，还含大肠杆菌的lacZ基因也常被用作为选择的标记。此基因编码β半乳糖苷酶。LacZ位于多位点接头(polylinker)上。有的还含有高效的启动子。

(2) λ噬菌体λ噬菌体(bacteriophage λ)为线状双链DNA病毒(约50kb)，感染大

肠杆菌。经改造的噬菌体有一、二个EcoRⅠ切点，并含有LacZ基因作为筛选的标志。当中的1/3序列不是病毒生活所必需，可以去除，而由外源DNA片段(5~25kb)替代。如图12-23所示。

β-半乳糖苷酶能分解一种化学品称为5-溴-4-氯-3吲哚-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro

-3-indolyl-galactoside，X-gal)，X即为5-bromo-4-chloro-3-indolyl，是一发色(蓝色)基团，当它与半乳糖以糖苷键结合时即为无色。但是X-gal经β-半乳糖苷酶作用后即将X基团释放出来而成蓝色。若LacZ被插入的DNA片段破坏，则不能产生β-半乳糖苷酶，因此在含有X-gal的培养基中成为无色的斑点。若LacZ完整，X-gal被β-半乳糖苷酶分解而成为蓝色的斑点，故可作为筛选的标志。

(3) 其他

2. 表达载体（expression vector）

表达载体是带有调控克隆基因表达必需的转录和翻译信号的克隆载体。克隆基因在细菌和其它细胞中的过量表达，能够产生大量的特异蛋白质。

（1）大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体（E.coli expression vector）除具有克隆载体所具备的性质以外，还带有控制在大肠杆菌中表达元件即转录和翻译所必需的DNA序列 : 启动子、操纵基因、编码阻遏物的基因、核糖体结合位点、转录终止信号。

（2）真核表达载体真核表达载体（eukaryotic expression vector）含有必不可少的原核序列，如在大肠杆菌中能够作用的复制子，便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因。但在质粒中还包括在真核细胞中生活和表达元件：启动子/ 增强子、克隆位点、终止信号和加poly(A) 信号、剪接供体和受体、复制起始点和选择标记基因。

(三) 工具酶

限制性内切酶(restriction enzyme或restriction endonuclease)，DNA连接酶、末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)、逆转录酶、S1核酸酶(切单链DNA或RNA)、碱性磷酸酶等均属工具酶。限制性内切酶是重组DNA技术中最关键的工具酶，现着重加以介绍。

限制性内切酶是微生物的一种自我保护的酶，它能识别双链DNA分子中特异碱基序列并切开。所以当外源DNA侵入细菌体时，细菌体为保护自身DNA的完整性，通过其所含的特有的限制性内切酶对外源DNA进行酶解，而自身的DNA分子中所含该限制性内切酶的识别碱基序列则被另一种酶进行甲基化而保护起来，故不被自己的限制性内切酶所切断。

限制性内切酶识别的DNA序列多数为4~6个碱基，新近发现一些能识别8个碱基的。识别碱基数少的酶对DNA切的机率多，碱基数大则少。所以识别8个碱基序列的酶，可用于分析大片段DNA，可切成上百乃至上千kb的片段。限制性内切酶的识别序列都具有回文或双重对称结构的特点。

切口：有两种切口。一种切开后，即成黏性末端(cohesive ends或sticky ends)，因为两个末端的碱基互补配对，易通过氢键相连。

有些限制性内切酶的切口，成为平头末端(blunt ends)

不同的DNA分子上若有某一种限制性内切酶的位点，均能被该酶切断，并产生相同的切口，这对重组DNA分子很有利。

拼接方法：

1. 黏性末端

2．均聚体尾部 (homopolymeric tailing)

3．化学合成的接头 (chemical synthetic linker)

三、重组DNA分子引入宿主细胞

(一) 原核细胞

最常用的是大肠杆菌，要选择合适的菌株(strain)。宿主细胞先经氯化钙处理，以改变细胞膜的通透性，使重组DNA分子容易进入。这种将重组质粒DNA分子引入细菌，使其在细菌体内扩增及表达的过程称为转化 (transformation)。

(二) 动物细胞

宿主细胞主动摄取或被动引入外源DNA片段或重组DNA分子的过程称为转染(transfection)。进入细胞内的DNA可以被整合至宿主的基因组中，也可以在染色体外生活表达，这就需要采用含有能在真核细胞生活的结构成分的载体。可用磷酸钙介导(calcium-phosphate mediated)使外源DNA形成沉淀颗粒，颗粒若沉着在动物细胞的表面，以利细胞将这些颗粒摄入。近年用脂质体(1iposome)介导外源DNA的转移，可提高转染效率。用电穿孔(electroporation)方法，将外源DNA与宿主细胞放入特别的装置内，在高压电脉冲作用下，细胞外的DNA分子会在细胞膜上穿孔而入，并最终进入细胞核内，整合至宿主基因组中。用基因枪（颗粒轰击particle bombardment）方法是将外源DNA包裹了化学性质稳定的金或钨微粒以后，在电子发射装置或高压气流的驱动下，以极高速度打入受体细胞，组织和器官中，以进行基因转移技术。

用逆转录病毒(retrovirus)作为载体可以成功地感染动物细胞。另外可用微注射(microinjection)的方法，将外源DNA分子直接注射入细胞内或核内。近年发展一种转基因(transgenic)小鼠方法，即将重组DNA分子注射于单细胞受精卵的原核内，然后再将其植入一假妊娠母鼠的子宫内。生下的小鼠在全身各组织细胞的基因组DNA中都含有这种外源DNA，可以研究在整体条件下外源DNA的功能。