吖啶橙染色常见问题-吖啶橙染色液一般用作什么检查

1、临床标本：宫颈分泌物，取自医院门诊妇产科就诊的非特异性阴道炎(NSV)患者，常规消毒用无菌棉签自宫颈口取分泌物于无菌生理盐水管中。

2、革兰染色法：取无菌生理盐水中的宫颈或阴道分泌物直接涂片，常规革兰染色，找到线索细胞者为阳性。

3、吖啶橙染色荧光法：取无菌生理盐水中的宫颈或阴道分泌物直接涂片，自然干燥，火焰固定，0.1 mmol/L吖啶橙染色37℃30 min，用0.01 mol/L PBS冲洗2次，0.01 mmol/L 氯化钙分色1 min，用0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗1次，甘油封片，荧光显微镜观察结果。在上皮细胞中发现成堆桔**细小杆菌为阳性。

4、分离培养鉴定法：将无菌生理盐水中的阴道或宫颈分泌物，以无菌手续接种于阴道加德纳菌专用分离培养基上，置5%二氧化碳培养箱37℃孵育48 h，挑取灰色、半透明、光滑、露滴状样菌落，如为革兰染色阴性小杆菌者，进行生化鉴定，生化鉴定标准按文献进行鉴定。

5、PCR检测法：(1)根据Belkum等报道加德纳菌位于IIS-23srRNA基因区为特异性引物序列，扩增片段：433bp。引物15′-TTTCGTGGAGGGTTCGATTCTGG-3′引物2 5′-TACA-AGCTGATAGGACGCG-3′由上海生物工程公司合成。(2)临床标本模板DNA的制备：将宫颈分泌物500μl生理盐水中，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加碱性裂解液，98℃10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液做模板。(3)PCR扩增和产物检测：反应总体积为25μl，包括10×PCR缓冲液2.5 μl，4×dNTP 1.5 μl，引物1，2各0.25 μl，无菌去离子水9.5μl，模板10 μl，Taq DNA聚合酶1 U/μl，以无菌石蜡油30 μl覆盖，进入PCR循环，循环参数为:95℃5 min，94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，32个循环，最后72℃延伸5 min。取扩增产物15 μl，于2%琼脂糖(含EB液)上100 V电泳30 min，于紫外光下观察结果，出现433 bp扩增带者为阳性，未见433 bp扩增带为阴性。 1、革兰染色找线索细胞仍是一种诊断细菌性阴道病的常规方法。

异染性染料，吖啶橙以插入方式与病原体双螺旋DNA分子结合，根据病原体DNA或RNA对吖啶橙染料的吸附方式不同所放射的荧光也不同，再加上加德纳菌在侵袭的靶目标为上皮细胞聚集，当吖啶橙染色后在荧光照射下，发射出桔红色荧光，能清晰地检测出加德纳菌在上皮细胞上的聚集现象，作出精确的诊断。

3、分离培养鉴定法是国际确认的金指标，临床上由于不正规的应用抗生素，导致许多病原体在一定程度上受到抑制，给分离培养带来困难，造成分离培养阴性结果，建议做分离培养应取材于治疗前的标本，需要专用的高营养的培养基，以提高分离培养的阳性检出率。

4、PCR技术具有高度的特异性和敏感性，选用特异的寡核苷酸引物序列，检测目的是病原体的遗传物质DNA不受抗生素治疗等药物治疗的影响，对彻底根治病原体有着极其重要的意义。

现在常用的核酸染料有哪几种

第一种方法最常用

1）紫外吸收法也就是测量OD（260）和OD（280）的吸收值,这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点,因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收.

（2）荧光法,用PicoGreen荧光染料,测定DNA,RNA浓度比较灵敏,并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA,并且受其它杂质的影响不大,缺点要有专门的荧光检测仪器,试剂比较昂贵.

纯化DNA可以买试剂盒,主要有膜吸附法,磁珠分离法,都很方便.

RNA与DNA最重要的区别一是RNA只有一条链,二是它的碱基组成与DNA的不同,RNA没有碱基T（胸腺嘧啶）,而有碱基U（尿嘧啶）.所以导致他们有以下性质上的不同.

1.两性解离：DNA无,只有酸解离,碱基被屏蔽（在分子内部形成了H键）.RNA有,有PI.

2.粘度大：DNA;RNA,粘度由分子长度/直径决定,DNA为线状分子,RNA为线团.

3.碱的作用：DNA耐碱RNA易被碱水解.

4.显色反应：

鉴别DNA和RNA+浓HCl RNA ------→ 绿色化合物

DNA ------→ 蓝紫色化合物苔黑酚

二苯胺啡啶溴红（荧光染料）和溴嘧啶都可对DNA染色,原理是卡在分子中,DNA的离心和电泳显色可用它们.

DNA和RNA的鉴别染色

利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA.吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定,非固定细胞核酸,或作溶酶体的一种标记.观察亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体.虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果,但该方法已被许多实验室广泛采用.

5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇,因此,常用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA.DNA溶于苯酚而RNA不溶,故可用苯酚来沉淀RNA.

6.紫外吸收：核酸的λm＝260nm,碱基展开程度越大,紫外吸收就越厉害.当A＝1时,DNA：50ug/ml,RNA和单链DNA：40ug/ml,寡核苷酸：20ug/ml.用A260/A280还可来表示核酸的纯度.

7.沉降速度：对于拓扑异构体（核苷酸数目相同的核酸）,其沉降速度从达到小依次为：RNA ; 超螺旋DNA > 解链环状DNA ; 松弛环状DNA ; 线形DNA也就是在离心管中最上层是线形DNA,最下面是RNA.

8.电泳：核苷酸、核酸均可以进行电泳,泳动速度主要由分子大小来决定,因此,电泳是测定核酸分子量的好方法.

9.DNA分子量测定最直接的方法：用适当浓度的EB（溴嘧啶）染色DNA,可以将其他形式的DNA变成线形DNA,用电镜测出其长度,按B-DNA模型算出bp数,根据核苷酸的平均分子量就可计算出DNA的分子量.

丫啶橙的配制方法

常用的核酸染料有:

1、EB染料

EB属于核酸分子嵌入剂，通常用于分子遗传学、DNA和染色质结构分析等研究中，特别是国内很多实验室仍在使用EB进行凝胶核酸电泳实验的染色。

EB是极易渗透细胞膜与胞内DNA嵌合的小分子，它具有平面共轭大环结构，是典型的DNA

分子插入试剂，菲啶环插入到DNA分子的碱基对之间，与DNA嵌合形成稳定的复合物，并影响DNA

的复制，破坏正常的遗传生理现象。EB作为诱变性的化合物，它在人体中诱导突变的机制是不可逆转的。

2、GoldView染料

GoldView(GV)是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于RNA染色。

实质上，所谓的Goldview就是吖啶橙，也就是传说中的AO，有一种传统的细胞凋亡试验，采用的染料正是吖啶橙，也就是AO/EB染色试验，EB无法穿透完整的细胞膜，而AO可以穿过细胞膜染上细胞核，以此来区分凋亡和未凋亡的细胞。

3、GelRed 和 GelGreen染料

GelRed

和GelGreen

是两种集高灵敏、低毒性和超稳定于一身的极佳的荧光核酸凝胶染色试剂。其水溶染色剂通过美国环保局安全认定，废弃物可直接倒入下水道，而不会造成任何环境污染。

GelRed

和 GelGreen

的特殊化学结构使其难以穿透细胞膜进入细胞，正是这一特性降低了染料的细胞毒性。不过也正是因为如此，其价格大约是GoldView的十倍左右。

扩展资料

核酸染料的科研应用：

1、免疫分析

荧光标记的单克隆抗体技术为流式细胞仪在研究细胞膜和细胞内各种功能性抗原、肿瘤基因蛋白等领域扩展了无限的应用空间。

荧光探针可以通过蛋白质交联剂共价结合在单克隆抗体上。免疫荧光标记最常用的染料有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻红蛋白（PE）以及AlexaFluor系列染料等。

2、核酸检测

核酸荧光染料对细胞核染色后定量测量细胞所发出的荧光强度，就可以确定细胞核中DNA、RNA的含量，并可以对细胞周期和细胞的增殖状况进行分析。

有多种荧光染料可以对细胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst 33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。

百度百科-荧光染料

核酸电泳染色剂有哪些

吖啶橙本身就是单一的分子，你说的是吖啶橙细胞染色的方法吧：

1．PBS洗盖玻片3次。

2.　再在冷的Carnoy's中固定10min

3．用Mcllvaine's　洗3次，每次5min

4．用Mcllvaine's将1％吖啶橙稀释为1:100

5．用0．01％吖啶橙染色盖玻片5min

6．在缓冲液中冲洗盖玻片5min

7．将盖玻片用缓冲液封固于载玻片上

8．用低倍和高倍物镜在荧光镜下观察。

电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂：

1、溴化乙锭（ethidium bromide, EB）

最常用的核酸荧光染料，可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。 EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶 浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这 样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。

在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了 核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光 易分解，应于4℃避光保存，

2、吖啶橙（acridine orange, AO）：

吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发 下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在 22℃，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。

3、银（Ag+）试剂：

Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及 RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的 RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA 片段回收的制备。

4、亚甲蓝（methylene blue）

可将RNA染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长。染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用净水洗5~8h（反复换水），带型肉眼可见，最低检测量为 250ng。