吖啶酯标记的化学发光反应体系反应时需要酸性环境-吖啶酯标记技术

2024-10-16 09:01:30

1、直接化学发光，标记物为吖啶酯（雅培）或者ABEI（新产业）

2、酶促化学发光，标记物为碱性磷酸酶（厦门波生）或者辣根过氧化物酶（强生）

3、电化学发光，标记物为三联吡啶钌（罗氏）

注：括号内为代表厂家。

简介：

化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。

直接化学发光常用的发光剂是

化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种:

(1)化学发光标记免疫分析法;

(2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析( chem ilum inescen t enzym e imm unoassay,

CL E IA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同[ 5 ]: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。常用的底物为鲁米诺(32氨基邻苯二甲酰肼,lum ino l) , 或其衍生物如异鲁米诺(42氨基邻苯二甲酰肼) , 是一类重要的发光试剂。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行, 在过氧化物酶及活性氧[ 过氧化阴离子(O 2- ) , 单线态氧(1O 2 ) , 羟自由基(OH·) , 过氧化氢(H2O 2) ]存在下,生成激发态中间体, 当其回到基态时发光, 其波长为425nm。

早期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体) , 但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体, 进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物, 在过氧化物酶和起动发光试剂(N aOH2H2O 2) 作用下, 鲁米诺发光, 发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。Kodak Am erliteTM 半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的。 (enhanced lum ines2cence enzym e imm unoassay, ELEIA )

在发光系统中加入增强发光剂, 如对2碘苯酚等, 以增强发光信号, 并在较长时间内保持稳定, 便于重复测量, 从而提高分析灵敏度和准确性。在全自动分析仪上, 还可通过计算机严密控制, 进行自动操作, 如加试剂, 混合, 温育, 洗涤, 加发光试剂, 发光计数, 数据处理, 绘制标准曲线, 直至完成病人血清样品的分析并打印出结果。Am erliteTM 发光增强酶免分析系统用荧光素、噻唑等增强剂, 其发光时间可持续长达20m in, 试剂盒有甲状腺功能检测的

促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素, 与性激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮, 以及其他方面的如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。所用底物为环1, 22二氧乙烷衍生物, 这是一类很有前途的发光底物 , 用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团——金刚烷基, 其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团, 在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。最常使用的底物是AM PPD [ 32(2’2 sp iroadam an2tane ) 42m ethoxy242( 3’2 pho spho ryloxy) 2phenyl21,22dioxetane ], 中文名为: 32(2’2 螺金刚烷) 242甲氧基242(3’2 磷酰氧基) 2苯基21, 22环二氧乙烷)。在碱性磷酸酶(AL P) 作用下, 磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基, 得到一个中等稳定的中间体AM PD (半寿期为2～ 30m in) , 此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子, 当其回到基态时产生470nm 的光, 可持续几十分钟(如图5)。AM PPD 为磷酸酯酶的直接化学发光底物, 可用来检测碱性磷酸酯酶或酶和抗体、核酸探针及其它配基的结合物。可检测到碱性磷酸酯酶的浓度为10- 15mo l?L 。

美国DPC 公司的Imm u lite 全自动酶放大发光免疫分析仪, 以碱性磷酸酶为标记物, 以金刚烷作发光底物, 测定灵敏度相当于10- 21mo l?mL 的酶, 采用聚苯乙烯珠作载体, 其检测水平已能达到10- 12g?mL。