吖啶橙染色观察口腔上皮荧光吗-吖啶橙(acridine orange)染色观察口腔上皮荧光

Hp的诊断方法有多种主要分为两大类：直接法和间接法。

1、细菌的直接检查

用培养、PCR、组织学方法直接检测胃黏膜内的Hp

(1)培养法：通过胃镜钳取胃窦黏膜作Hp培养是最精确的诊断方法，可作为验证其他诊断性试验的金标准。此外，还可提供细菌的药物敏感试验，指导临床选用药物，尤其是治疗失败者或生活在Hp耐药性很高的国家与地区。Hp培养法特点是特异性高但敏感性居中操作技术难，耗费时间较长，培养需3～6天，即使是有经验的实验师操作，培养成功率也仅达75%～95%。影响Hp生长，造成假阴性结果的因素有许多，如培养标本不含Hp；胃镜检查时吞咽表面；活检钳污染；或最近使用过抗生素或铋剂，这些均能抑制细菌生长。此外标本接种时间与分离培养基是否新鲜也有关。

最近报道从人的粪便中也可培养出Hp，但需在微氧的环境下离心，浓缩细菌而获得，因为只能在50%Hp定植患者的粪便中检出，所以对此非侵袭方法尚需作进一步研究。

(2)组织切片法：另一种Hp的直接检查法，能提供组织形态学的信息因为Hp定居在人胃黏液的黏液下层上皮细胞表面，正常情况下该部位不存在其他细菌，因此根据在组织切片上的形态特点和分布特征 (在胃黏液和胃腔之间存在螺旋杆菌状物)，即可诊断Hp感染，是较可靠的方法组织学检查特点是敏感性高，可同时做病理检查，并可永久保存资料。染色方法很多包括HE染色、Gram染色、碳酸复红染色、W-S(Warthin-Starry)染色、Giemsa(吉姆萨)染色等。革兰染色，因检出率低几乎已不用；标准HE染色能检出Hp但也不是可靠的方法，W-S银染是很好的技术，尽管价格和技术要求高，由于检测有效临床应用较为普遍，吉姆萨染色费用较少，一些作者认为此方法在质量上与W-S银染相等。

除常规的组织学检查外，还有免疫化学和免疫荧光方法但需使用免疫荧光镜和免疫抗体，使检查变得更昂贵，且又不能提供常规组织学发现以外的信息，因而不能常规使用，多用于实验室研究。

(3)直接涂片染色：用相差显微镜直接检查涂于玻片上的胃黏液中Hp。可用吖啶橙染色革兰染色Giemsa染色

(4)PCR（聚合酶联反应）：PCR是检测Hp是否存在另一种方法，特点是即能快速检测到新鲜胃黏液标本中的Hp，也能检测石蜡包埋的活检样本。PCR的引物对所有Hp菌株是特异的故具有高度特异性。和快速尿素酶、培养法和组织学比较，PCR又具有高度敏感性。但一些隐匿的因素能影响此高度的敏感性和特异性如内镜和活检钳清洗消毒不严导致DNA污染，使特异性降低，使敏感性降低的因素有细菌在胃黏膜的斑块状定植或PCR抑制因素的存在PCR可用于Hp感染的临床诊断，流行病学调查，Hp的分子遗传学研究

2、细菌的间接检查

利用细菌的生物特性，特别是Hp水解尿素的能力而产生呼气试验，尿素酶试验。血清学因不能提供细菌当前是否存在的依据，故不能用于感染的诊断，主要用于筛选或流行病学调查。对临床医师来说根据医院的条件选择合适的方法用于病人是重要的，主要采用联合方法诊断。

（1）快速尿素酶试验：因Hp是人胃内惟一能够产生大量尿素酶的细菌，故可通过检测尿素酶来诊断Hp感染尿素酶分解胃内的尿素生成氨和二氧化碳，使尿素浓度降低，氨浓度升高。基于此原理，已发展了多种检测方法。

胃黏膜活检组织快速尿素酶试验为临床应用最广泛的一种方法，具有简便、实用快速灵敏等优点但受细菌数量影响，活检组织中Hp数量很少时，易出现假阴性；在使用铋剂氨苄西林甚至H2受体拮抗药治疗后尿素酶试验的敏感性明显降低，故此方法主要用于最初检测Hp感染。所用的方法有如下两种。

①pH指示剂法：试剂中含有尿素和pH指示剂（如酚红pH 6.8时为黄棕色pH 8.4时为粉红色）。从胃内取出的标本通常呈酸性（pH＜6.0），一般情况下试剂的颜色不变，如果胃内有Hp感染，当黏膜标本放入试剂中，Hp所产生的尿素酶则分解尿素产生氨使pH值升高，试剂变为粉红色。

②分析化学法：采用分析化学原理检测Hp尿素酶的最终产物由于阳性显色反应不是取决于试剂中pH改变，可以避免一些影响pH的因素所致的假阴性。福建三强生化有限公司生产的CPUT试剂盒属于这种方法，可半定量指示Hp感染的程度。

（2）呼气试验：用核素标记尿素，口服后测定呼气中标记的CO2量，能间接反映尿素酶的量，属非侵入性检查。呼气试验具有快速、可靠、安全无痛苦的优点，适合大规模流行病学调查表明是否有Hp感染，而不是曾否有过感染，因此优于血清学检查有研究发现服用胶态次枸橼酸铋剂2h后即可见14CO2量明显降低，因此用于疗效观察是一种较敏感的指标，也是随访的一种理想方法呼气试验根据标记物的不同，分为13C-尿素呼气试验(breath test)和14C-尿素呼气试验

（3）13C-尿素呼气试验：受试者口服13C-尿素5mg/kg，随后每10min收集一次呼气标本，连续3h。如果胃内有Hp感染，口服的13C-尿素溶液在尿素酶的作用下分解成13CO2经胃肠道吸收后呼出。收集的气体标本用质谱仪分析，计算13CO2含量。有Hp感染者在口服试液后20min即出现13CO2升高，在100min内持续升高，而无Hp感染者无13CO2呼出13C为稳定性核素，无放射性，可反复检查。但13CO2测定较为复杂，需用质谱仪，费用昂贵，多数医院尚不能开展

（4）14C-尿素呼气试验：为了克服13C-尿素呼气试验操作复杂、费用昂贵的缺点用14C-尿素取代13C-尿素，得到同样满意的效果。检测14C用液体闪烁计数器即可，因而更为实用。其缺点是14C有一定的放射性，不适合于孕妇及儿童。

影响呼气试验精确性因素：假阴性结果最常见原因是用抗生素、铋剂或奥美拉唑不久后做的呼气试验（一般要求在治疗结束后至少1个月再进行）；其次是尿素从胃排空过快或样本收集太迟。假阳性结果为体内存在或口腔内存在有尿素酶活性的细菌。

但呼气试验仅能提供Hp存在的信息，而不能区分消化道疾病，无法代替胃镜检查，不能作为有上消化道症状儿童的最初评价方法。

（5）血清学检查：Hp的血清学诊断是非侵袭和间接的方法主要用于流行病学或筛选，不能单纯作为Hp感染最初的诊断工具，除非和其他方法联合应用。血清学检查的基础是Hp具有诱导机体局部和全身产生免疫反应的能力，用细菌凝集、补体结合和ELISA三种方法能检测到Hp抗体，ELISA由于操作简单，诊断快速，价格便宜和敏感性高等因素，故临床应用较多。

ELISA方法有2种：

①定性试验：以阴或阳性表示，不仅用于血清，也可用于唾液、牙龈分泌物特别适用儿童，缺点是假阳性率高，故阳性结果常需补充另一个肯定方法。

②定量试验：由机器测试，结果更精确还可用于治疗后的随访检查。

血清学试验由于为非侵入性且简单，是一个理想的筛选试验，小儿中由于Hp感染比成人少。阳性发现较成人更有助于诊断，文献报道小儿中IgG抗体含量与细菌的多少或胃炎组织学严重程度之间有一定相关性。但血清学不能作为单一的诊断试验用且因Hp根除后抗体下降缓慢，故也不能用于抗菌治疗后的即刻随访

血Hp免疫印迹法：Hp-IgG抗体、cagA、vacA蛋白抗体，可用于区分感染的菌株的类型，但价格昂贵。

Hp诊断检测方法的比较。

1、临床标本：宫颈分泌物，取自医院门诊妇产科就诊的非特异性阴道炎(NSV)患者，常规消毒用无菌棉签自宫颈口取分泌物于无菌生理盐水管中。

2、革兰染色法：取无菌生理盐水中的宫颈或阴道分泌物直接涂片，常规革兰染色，找到线索细胞者为阳性。

3、吖啶橙染色荧光法：取无菌生理盐水中的宫颈或阴道分泌物直接涂片，自然干燥，火焰固定，0.1 mmol/L吖啶橙染色37℃30 min，用0.01 mol/L PBS冲洗2次，0.01 mmol/L 氯化钙分色1 min，用0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗1次，甘油封片，荧光显微镜观察结果。在上皮细胞中发现成堆桔**细小杆菌为阳性。

4、分离培养鉴定法：将无菌生理盐水中的阴道或宫颈分泌物，以无菌手续接种于阴道加德纳菌专用分离培养基上，置5%二氧化碳培养箱37℃孵育48 h，挑取灰色、半透明、光滑、露滴状样菌落，如为革兰染色阴性小杆菌者，进行生化鉴定，生化鉴定标准按文献进行鉴定。

5、PCR检测法：(1)根据Belkum等报道加德纳菌位于IIS-23srRNA基因区为特异性引物序列，扩增片段：433bp。引物15′-TTTCGTGGAGGGTTCGATTCTGG-3′引物2 5′-TACA-AGCTGATAGGACGCG-3′由上海生物工程公司合成。(2)临床标本模板DNA的制备：将宫颈分泌物500μl生理盐水中，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加碱性裂解液，98℃10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液做模板。(3)PCR扩增和产物检测：反应总体积为25μl，包括10×PCR缓冲液2.5 μl，4×dNTP 1.5 μl，引物1，2各0.25 μl，无菌去离子水9.5μl，模板10 μl，Taq DNA聚合酶1 U/μl，以无菌石蜡油30 μl覆盖，进入PCR循环，循环参数为:95℃5 min，94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，32个循环，最后72℃延伸5 min。取扩增产物15 μl，于2%琼脂糖(含EB液)上100 V电泳30 min，于紫外光下观察结果，出现433 bp扩增带者为阳性，未见433 bp扩增带为阴性。 1、目前革兰染色找线索细胞仍是一种诊断细菌性阴道病的常规方法。

2、吖啶橙染色免疫荧光检测法是近年来一种新的较为理想的检测手段，由于吖啶橙是一种具有异染性染料，吖啶橙以插入方式与病原体双螺旋DNA分子结合，根据病原体DNA或RNA对吖啶橙染料的吸附方式不同所放射的荧光也不同，再加上加德纳菌在侵袭的靶目标为上皮细胞聚集，当吖啶橙染色后在荧光照射下，发射出桔红色荧光，能清晰地检测出加德纳菌在上皮细胞上的聚集现象，作出精确的诊断。

3、分离培养鉴定法是国际确认的金指标，临床上由于不正规的应用抗生素，导致许多病原体在一定程度上受到抑制，给分离培养带来困难，造成分离培养阴性结果，建议做分离培养应取材于治疗前的标本，需要专用的高营养的培养基，以提高分离培养的阳性检出率。

4、PCR技术具有高度的特异性和敏感性，选用特异的寡核苷酸引物序列，检测目的是病原体的遗传物质DNA不受抗生素治疗等药物治疗的影响，对彻底根治病原体有着极其重要的意义。