吖啶酯标记物稀释液长期保存专利-吖啶酯对应的发光底物

2024-10-14 23:01:31

2017年检验技师考试免疫学考点总结

　免疫学检验是检验技师考试的考点之一。为了方便考生更好的复习关于免疫学检验的知识。下面是我为大家带来的关于免疫学检验的知识，欢迎阅读。

　0、免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应。

　1、免疫：是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能

　2、免疫防御(对外);免疫自稳(防自身免疫病);免疫监视(防肿瘤)。

　3、中枢免疫器官：骨髓、胸腺;外周免疫器官：淋巴结、脾脏(最大)、黏膜相关淋巴组织

　4、B细胞：通过识别膜免疫球蛋白来结合抗原，介导体液免疫;B细胞受体=BCR=mIg

　表面标志：膜免疫球蛋白(SmIg)、Fc受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红细胞受体。

　成熟B细胞：CD19、CD20、CD21、CD22 (成熟B细胞的mIg主要为mIgM和mIgD)同时检测CD5分子，可分为B1细胞和B2细胞。

　B细胞功能检测方法：溶血空斑形成试验(体液免疫功能)。

　5、T细胞：介导细胞免疫。共同表面标志是CD3(多链糖蛋白);辅助T细胞的标志是CD4;杀伤T细胞的标志是CD8;T细胞受体=TCR。

　T细胞和NK细胞的共同表面标志是CD2(绵羊红细胞受体);

　CD3+CD4+CD8- = 辅助性T细胞(Th)

　CD3+CD4-CD8+ = 细胞毒性T细胞(Tc或CTL)(T细胞介导的细胞毒试验)

　CD4+CD25+ = 调节性T细胞(Tr或Treg)

　T细胞功能检测：植物血凝素(PHA)刀豆素(CONA)刺激T细胞增殖。增殖试验有：形态法、核素法。

　T细胞亚群的分离：亲和板结合分离法，磁性微球分离法，荧光激活细胞分离仪分离法

　*E花环试验是通过检测SRBC受体而对T细胞进行计数的一种试验;

　6、NK细胞：具有细胞介导的细胞毒作用。直接杀伤靶细胞(肿瘤细胞和病毒感染的细胞)

　表面标志：CD16(ADCC)、CD56。

　测定人NK细胞活性的靶细胞多用K562细胞株，而测定小鼠NK细胞活性则常采用YAC-1细胞株。

　7、吞噬细胞包括：单核-吞噬细胞系统(MPS，表面标志CD14，包括骨髓内的前单核细胞、外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞)和中性粒细胞。(表达MHCⅡ类分子)

　8、人成熟树突状细胞(DC)(专职抗原呈递功能)：表面标志为CD1a、CD11c和CD83。

　9、免疫球蛋白可分为分泌型(sIg，主要存在于体液中，具有抗体功能)及膜型(mIg，作为抗原受体表达于B细胞表面，称为膜表面免疫球蛋白)

　10、免疫球蛋白按含量多少排序：IgG>IgA>IgM>IgD>IgE五类(按重链恒定区抗原性(CH)排序)

　免疫球蛋白含量测定：单向环状免疫扩散法、免疫比浊法。

　11、免疫球蛋白的同种型抗原决定簇位于恒定区(CH、CL)

　12、抗体由浆细胞产生。抗体分子上VH和VL(高变区)是抗原结合部位。

　13、IgG：血清中含量最高的免疫球蛋白(IgG1最高)，血液和细胞外液中的主要抗体。也是再次免疫应答的主要抗体，是唯一能通过胎盘的抗体，大多数抗菌抗体、抗病毒抗体是IgG，某些自身抗体及超敏Ⅱ型抗体是IgG，免疫学检测中第二抗体也以IgG为主。

　14、IgA：分血清型(单体存在)及分泌型;分泌型IgA(sIgA)为二聚体，性能稳定，主要存在于胃肠道、支气管分泌液、初乳、唾液、泪液中，局部浓度高，是参与黏膜局部免疫的主要抗体。

　15、IgM：为五聚体，主要存在于血液中，是Ig中分子量最大的(又称巨球蛋白)。个体发育最早合成和分泌的抗体。抗原刺激后体液免疫应答中最先产生的抗体，感染过程中血清IgM水平升高，说明近期感染。新生儿脐血中若IgM增高，提示有宫内感染。

　16、IgE：为单体结构，正常人血清中含量最低。IgE为亲细胞抗体，介导Ⅰ型超敏反应。特异性过敏反应和寄生虫早期感染患者血清中可升高。

　17、补体：具有酶样活性的球蛋白(肝细胞、巨噬细胞产生);激活途径主要有三种：经典途径(以结合抗原后的IgG或IgM类抗体为主要激活剂(双链DNA)，C1～C9全部参与)、替代途径(病原微生物细胞壁成分(脂多糖)直接激活补体C3，然后完成C5～C9的激活过程)、MBL途径(由急性炎症期产生的甘露糖结合凝集素(MBL)与病原体结合后启动激活)。

　18、补体系统中C3含量最多，C2含量最少。

　19、灭活：加热56℃30分钟，补体丧失活性

　20、补体清除免疫复合物的方式：吞噬调理;免疫粘附;免疫复合物抑制。

　21、完全抗原=反应原性+免疫原性。半抗原=反应原性(无免疫原性)

　22、抗原抗体结合力(分子间引力)：静电吸引、范德华力、氢键、疏水作用力(最强)

　23、抗原抗体反应的四大特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性;受反应条件(如温度、pH、电解质、抗原抗体比例等)的影响。

　24、抗体过量前带;抗原过量后带(钩状效应)

　25、抗原抗体反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应;第二阶段为可见反应阶段，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。

　26、颗粒性抗原出现凝集反应。可溶性抗原出现沉淀反应。单价抗原与相应抗体结合不出现沉淀现象。

　27、木瓜酶水解IgG为2Fab+Fc;胃蛋白酶水解IgG为F(ab)2+nFc。

　28、最常用于免疫动物的佐剂是弗氏佐剂，弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂(弗氏不完全佐剂加卡介苗)和弗氏不完全佐剂两种。

　29、R(兔子)型抗血清是用家兔及其他动物免疫产生的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较宽，适于作诊断试剂。

　H(马)型抗血清是用马等大动物免疫获得的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较窄，一般用作免疫治疗。

　30、抗血清常见保存条件：2-8℃保存;冷冻保存(最常用);真空干燥保存(5-10年)。

　31、杂交瘤细胞放入液氮(-196℃)前，需要逐步降温。复苏细胞时，从液氮罐内取出冻存管，立即浸入37℃水浴。

　32、凝集反应分为两个阶段：①抗原抗体的特异性结合;②出现可见的颗粒凝聚。

　33、直接凝集反应的原理是细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质(0.85%氯化钠)参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。抗原=凝集原，抗体=凝集素。

　34、玻片凝集试验：主要用于抗原的定性分析，AB0血型的测定。

　试管凝集试验：肥达氏试验、外斐试验、输血交叉配血试验;

　35、红细胞包被抗原，用以检测抗体的血凝反应，称为正向间接血凝反应(PHA)。

　红细胞包被抗体，用以检测抗原的血凝反应，称为反向间接血凝反应(RPHA)。

　36、间接血凝抑制试验：可用于检测抗体、自身抗体、变态反应性抗体，也可测定抗原。

　37、金**葡萄球菌A蛋白(SPA)

　38、血凝试验可在微量滴定板或试管中进行，将标本倍比稀释，一般为1:64，同时设不含标本的稀释液为对照孔。凡红细胞沉积于孔底，集中呈一圆点的为不凝集。如红细胞凝集，则分布于孔底周围。

　39、明胶凝集试验(间接)：HIV-1抗体和抗精子抗体检测

　40、抗球蛋白试验，又称Coombs试验，是检测抗红细胞不完全抗体的一种很有用的方法。包括直接Coombs试验(检测红细胞上的不完全抗体)和间接Coombs试验(游离在血清中的不完全抗体)

　41、沉淀反应分两个阶段：第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见。第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。

　42、免疫比浊：最适pH为6.5～8.5，磷酸盐缓冲液。

　43、对流免疫电泳：抗体流向负极，抗原流向正极

　44、免疫固定电泳也用予尿液中本-周蛋白的检测及?、?分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型。

　45、RIA(放免)核素(125Ⅰ)标记抗原，竞争抑制(标记抗原和非标记抗原竞争限量抗体);IRMA(免疫放射)核素标记抗体，非竞争结合(过量标记抗体，反应速率比RIA快，灵敏度明显高于RIA。)

　RIA可以测定大分子和小分子抗原，但IRMA则只能测定至少有两个抗原决定簇的抗原。

　46、常用的荧光素有：异硫氰酸(FITC)黄绿色，最常用;四乙基罗丹明(RB200)橘红色;四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)橙红色;藻红蛋白(R-RE)橙色。其他：铕(Eu3+)

　47、荧光标记蛋白的常用方法：搅拌法和透析法。

　荧光抗体效价鉴定：抗原含量为1g/L时，抗体效价>1：16

　48、时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)以镧系元素(如：铕)化合物为荧光标记物。

　49、偏振免疫测定的偏振波长是485nm(蓝光)。

　50、辣根过氧化物酶(HRP)：底物(1)邻苯二胺(OPD)，(2)四甲基联苯胺(TMB) ELISA中应用最广泛的底物。

　碱性磷酸酶(ALP)：底物：对-硝基苯磷酸脂(p-NPP)

　?-半乳糖苷酶(?-Gal)：底物：4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷(4-MUU)

　51、异相法：先分离，后测定;均相法：不分离，直接测。

　52、酶联免疫吸附试验(ELISA)：

　必要的试剂：①固相的抗原或抗体;②酶标记的抗原或抗体;③酶反应的底物。

　抗原测定：蛋白大分子抗原用得最多的是双抗体夹心法(HBsAg)。只有单个抗原决定簇的小分子，则使用竞争抑制法。

　抗体测定：通常使用间接法(HCV、HIV)、双抗原夹心法(HBsAb)、竞争法(HBcAb、HBeAb)和捕获法(IgM)等

　*待测孔最后显示的颜色深浅与标本中的待测抗原或抗体呈正相关的是：双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体;

　53、化学发光底物有：直接化学发光剂：吖啶酯和三联吡啶钌;酶促反应发光剂：(标记酶HRP)鲁米诺及其衍生物、(标记酶为碱性磷酸酶)AMPPD;

　54、免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。

　55、外周血单个核细胞的分离的分层液常用：Ficoll(由上到下为血浆，单个核细胞，粒，红)和Percoll(由上至下：细胞，单个核细胞，淋，红，粒)。

　56、纯淋巴细胞群的采集有：黏附贴壁法，吸附柱过滤法，磁铁吸引法，Percoll分离液法。

　57、T细胞和B细胞的分离：E花环沉降法，尼龙毛柱分离法

　58、淋巴细胞活力测定：台盼蓝染色法，细胞为蓝色。

　59、CD4是HIV受体，HIV感染时CD4/CD8比值明显降低。

　60、CD4/CD8升高常见于自身免疫性疾病;而CD4/CD8降低常见于病毒感染、恶性肿瘤和再生障碍性贫血等。

　61、(ELISA)双抗体夹心法是用于细胞因子测定的最常用方法。

　62、流式细胞仪：前向散射光(FS)反映颗粒的大小。侧向散射光(SS)反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度。荧光(FL)反映颗粒被染上荧光部分数量的多少。

　63、免疫荧光标记最常用的荧光染料：异硫氰酸荧光素(FITC)亮绿色荧光。德州红红色荧光。藻胆蛋白类橙色至红色荧光。

　64、临床上常用三色荧光抗体标记将CD3-CD16+CD56+淋巴细胞确定为NK细胞。

　65、AIDS患者的一个特征性免疫诊断指标表现为：T淋巴细胞总数减少，T细胞亚群CD4Th/CD8Tc比例倒置，Th/Tc<1.0，Th细胞数量显著下降甚至测不出，而Tc细胞数量可正常或增加，NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞群则处于正常范围。

　65、强直性脊柱炎HLA-B27

　66、SLE患者以IgG、IgA升高较多见。类风湿关节炎患者以IgM增高为主。

　67、M蛋白(MP)是B淋巴细胞或浆细胞单克隆异常增殖(>30g/L)所产生的一种在氨基酸组成及顺序上十分均一的异常单克隆免疫球蛋白。多无免疫活性，故又称副蛋白。临床上多见于多发性骨髓瘤、高丙种球蛋白血症、恶性淋巴瘤、重链病、轻链病等

　68、M蛋白-最基本方法：血清蛋白区带电泳技术

　M蛋白-粗筛试验：血清免疫球蛋白定量(单向琼脂免疫扩散法和免疫比浊法)

　M蛋白-鉴定，首选方法：免疫固定电泳(IFE)技术(区带电泳技术与特异性抗血清的免疫沉淀反应相结合)是临床最常用的方法。

　69、IgD降低见于原发性无丙种球蛋白血症、矽肺

　70、CSF中的浓度：IgG>IgA>IgM。神经系统肿瘤时，以IgA和IgM升高为主。

　(感染、血管病变、系统性疾病=IgG升高)

　71、本-周蛋白即尿中游离的免疫球蛋白轻链。尿中可测得，血中呈阴性(原因是本-周蛋白分子量小，极易迅速自肾脏排出，血中含量并不升高)

　72、冷球蛋白又称冷免疫球蛋白，在-4℃时发生沉淀，于37℃时又复溶解。采血是冷球蛋白检测的关键，宜在体温条件下采集和保存静脉血。

　73、补体结合试验(CFT)，梅毒的诊断，华氏反应。

　74、非均相荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定法。

　均相荧光免疫测定：荧光偏振免疫测定法。

　75、链球菌感染：ASO(胶乳凝集试验、免疫散射比浊法)

　76、伤寒沙门菌有菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原和表面(Vi)抗原。肥达反应，效价?1:80为阳性

　77、卡氏肺孢菌，又称卡氏肺孢子虫，为类真菌。

　78、Ⅰ型超敏反应：由特异性IgE抗体介导产生，其发生速度最快。(青霉素、支气管哮喘)

　提高Th1细胞活性，减少IL-4的分泌，可降低IgE的产生，阻断IgE介导的Ⅰ型超敏反应。

　参与Ⅰ型超敏反应：肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞。

　79、Ⅱ型超敏反应：又称细胞毒型或细胞溶解型超敏反应，它是由靶细胞表面的抗原与相应IgG或IgM类抗体结合后，在补体(细胞溶解)、巨噬细胞(吞噬)和NK细胞(ADCC作用)参与下，引起的以细胞溶解或组织损伤为主的病理性免疫反应。(输血反应、新生儿溶血症、自身免疫性溶血性贫血、药物过敏性血细胞减少症、肺出血肾炎综合征、甲状腺功能亢进)

　80、Ⅲ型超敏反应：由可溶性免疫复合物沉积于局部或全身多处毛细血管基底膜，通过激活补体，并在血小板、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞等的参与下，引起的以充血水肿、局部坏和中性粒细胞浸润为主要特征的炎症反应和组织损伤。(Arthus反应、类Arthus反应、血清病、链球菌感染后肾小球肾炎、类风湿关节炎、SLE)/81、Ⅳ型超敏反应：又称迟发型超敏反应(DTH)，是效应T细胞与特异性抗原结合后，引起的以单个核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎症反应。(细胞免疫)效应性CD4+Th1细胞识别抗原后活化，可释放IFN-?、TNF、淋巴毒素(LT)、IL-3、GM-CSF、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等多种细胞因子。

　常见Ⅳ型超敏反应性疾病：感染性迟发型超敏反应(结核分枝杆菌、病毒、原虫)、接触性皮炎、移植排斥反应。(结核菌素皮试、斑贴试验)

　82、变性的IgG可刺激机体产生抗变性IgG抗体(类风湿因子)

　83、ITP患者血清中存在有抗血小板抗体，该抗体可以缩短血小板的寿命。

　84、抗乙酰胆碱受体抗体：对重症肌无力(MG)具有诊断意义。

　85、毒性弥漫性甲状腺肿患者血清中有抗促甲状腺激素受体(TSHR)的IgG型自身抗体。(甲状腺功能的'亢进)

　86、多发性肌炎是以损害肌肉为主要表现的自身免疫性疾病，如果同时有皮肤损害，则称为皮肌炎。

　87、75%的PSS患者有抗核抗体阳性，抗Scl-70抗体是PSS的特异性抗体，80%～95%的局限性硬皮病患者抗着丝点抗体阳性。

　88、自身免疫病(AID)的特征：高滴度自身抗体，病理特点为免疫炎症损伤与抗原分布一致，能建动物模型。

　89、抗DNP抗体(抗核蛋白抗体)通常完全被DNA和组蛋白吸收，是形成狼疮细胞的因子。

　90、ANA阳性的荧光现象分：核膜型、均质型、斑点型、核仁型。ANA常为自身免疫病的初筛试验。

　91、ENA是可提取核抗原的总称，分子中不含DNA。

　92、抗dsDNA抗体对SLE有较高的特异性。抗Sm抗体也是SLE的特异性标志之一。此两项常为SLE确诊指标。(对疑为SLE的患者，应先进行ANA和抗dsDNA抗体的检测，当ANA和(或)抗dsDNA抗体阳性时，再作抗ENA抗体谱的检测。如有抗Sm抗体和(或)抗RNP抗体阳性，可实验室诊断为SLE)

　93、抗核RNP抗体：为MCTD(混合性结缔组织病)的诊断指标。

　94、抗SSA/抗SSB抗体：为干燥综合征(SS)的诊断指标。(当ANA阳性而抗dsDNA抗体阴性，抗ENA抗体谱中抗SsA抗体和(或)抗ssB抗体阳性，可实验室诊断为干燥综合征。)

　95、抗Jo-1抗体：多发性肌炎(PM)患者常为阳性。

　96、抗Scl-70抗体：进行性系统性硬皮症(PSS)的诊断指标。

　97、NCA：原发性小血管炎的特异性血清标志物

　98、内风湿性关节炎(RA)：自身抗体有RF、抗角蛋白抗体(AKA)、抗环瓜氨酸肽抗体(anti-CCP)。

　99、Farr法测定dsDNA抗体的特异性高，为公认标准法，当抗dsDNA抗体结合率大于20%时对SLE有意义。

　100、抗线粒体抗体(AMA)：原发性胆汁性肝硬化

　101、巨球蛋白血症：以分泌IgM的浆细胞恶性增殖为病理基础的疾病。好发于老年男性，主要表现骨髓外浸润，以肝、脾和淋巴结肿大为主要体征并伴有血黏滞过高综合征，如表现为视网膜出血。(血清呈胶冻状难以分离，电泳时血清有时难以泳动，集中于原点是该病的电泳特征)

　102、异常免疫球蛋白检测的应用原则

　初筛实验：区带电泳分析、免疫球蛋白定量检测和尿本-周蛋白定性检测。

　确证实验：免疫电泳、免疫固定电泳、免疫球蛋白亚型、血清及尿中轻链蛋白的定量检测。

　103、HIV诱导的免疫应答

　1.体液免疫应答HIV感染后，机体可产生：中和抗体、抗P24壳蛋白抗体、抗gp120和抗gp41抗体

　2.细胞免疫应答：CD8+T细胞应答、CD4+T细胞应答。

　104、HIV抗原检测：核心抗原p24(ELISA)

　105、免疫印迹法判断标准为：①HIV抗体阳性：至少有两条膜带(gp41/gp120/gp160)或至少一条膜带与p24带同时出现;②HIV抗体阴性：无HIV抗体特异性条带出现;③HIV抗体可疑：出现HIV特异性条带，但带型不足以确认阳性者。

　CD4+T细胞计数是反映HIV感染患者免疫系统损害状态的最明确指标。当CD4+T细胞低于500/?l，则易机会性感染;低于200/?l，则发生AIDS。

　106、CEA大于60?g/L时可见于结肠、胃、肺癌。手术6周后CEA水平正常。

　107、AFP原发性肝癌。PSA前列腺癌

　108、糖类抗原有：CA125：上皮性卵巢癌和子宫内膜癌;CA15-3：乳腺癌;CA19-9：胰腺癌、结直肠癌。

　109、神经母细胞瘤和小细胞肺癌(基因有P53，RB)的标志物：神经元特异性烯醇化酶(NSE)

　110、排斥反应有：宿主抗移植反应(HVGR)和移植物抗宿主反应(GVHR)。

　111、移植物存活与HLA配型的关系是：①供、受者HLA-A和HLA-B相配的位点数越多，移植物存活几率越高;②供、受者HLA-DR位点相配更重要，因为HLA-DR和HLA-DQ基因有很强的连锁不平衡，DR位点相配的个体，通常DQ位点也相配;③不同地区HLA匹配程度与移植结果的关系有着不同的预测价值。

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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，许多大中型城市，乳腺癌已居女性恶性肿瘤亡率的首位。乳腺癌复发转移是导致乳腺癌患者亡的最主要原因，淋巴结阴性的患者中约有24%～30%出现复发转移，淋巴结阳性的患者中复发转移率高达50%～60%，而转移性乳腺癌的5年生存率仅为26%。

萤火虫荧光素酶（Luciferase）是一种常用的信号分子，可以用来标记肿瘤细胞.

一．细胞方法

将带有荧光素luc转酶报告基因的真核表达重组质粒pRc/CMV2-7，利用G418筛选，获得稳染人乳腺癌细胞株MCF-7-luc，并在稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆MCF-7体外评价其发光能力。通过建立裸鼠移植瘤模型，利用活体生物发光成像系统检测肿瘤生长及转移情况，为下一步监测裸鼠移植瘤对药物作用的变化情从而为分析药物对肿瘤的治疗效果提供理想的状况.

G418筛选浓度的确定：

37℃细胞培养箱中常培养,G418按0、200、400、600、800、1000μg/ml设置6个浓度梯度。在细胞接种24h后，加入6孔板中，每个浓度设2个孔在10～14d内全部亡。每天观察细胞生长情况，亡最低的G418浓度，即为筛选质粒转染克隆MCF－7细胞的浓度。

1)细胞转染

取对数生长期的MCF－7细胞，将细胞接种于6孔板内待细胞融合度达到80%～90%孔培养板中，TM即可转染。按照Lipofectamine2000试剂盒操作指南进行转染。在250μl无血清、无双抗的DMEM培培养基中加入luc质粒8μg/ml的pRc/CMV2-在250μl无血清、无双抗的DMEM培养基中加入10μlLipofectamineTM2000，室温培育5min。将上述2种稀释液混匀，室温培育30min后加入细胞孔板中，置于培养箱常规培养。

转染24h后胰酶消化细胞并按1∶6比例接种到新6孔板中，同时加入实验确定的浓度G418，随后每2d更换一次培养基并维持G418筛选直至单细胞抗性克隆的出现。分别挑选单一抗性克隆至96孔板，待其逐渐增殖后转入24孔板中继续传代培养。

3)荧光素酶活性鉴定阳性克隆

单一抗性克隆传代至第五代时用LuciferaseAs-sayAystem检测荧光素酶活性。检测时，各克隆按1×105个/孔接种到24孔板，24h后细胞裂解液裂解12000rpm，4℃离心10min，收集裂解物，取上清10μl加入96孔白板中，向每孔加入50μl荧光素酶96microplateluminometer连续读底物，停留2s后，取10s的荧光值（RLU），每个克隆设3个复孔，保留RLU值高的细胞克隆继续传代培养，再过5代后进行荧光素酶活性检测。保留RLU值维持较高的克隆直至第30代，荧光素酶活性最高的几个克隆MCF-7-luc即为阳性克隆.

各不同数量细胞克隆的荧光值检测7-luc阳性克隆细胞按细胞数将筛出的MCF-4×104、2×104、1×104、5000、2500、1250、625、312和156分别接种到96孔黑板中，另外一组仅有细胞，一组仅有培养基作对照，设置2个复孔，常规培去上清并用PBS洗两次，每孔加入100μl养24h后，Luciferin使其终浓度为150μg/ml，PBS，再加入D-立即用活体成像系统检测，分析发光强度与细胞数之间的相关性。

4)细胞生长曲线绘制

MCF7-luc细胞和作为对照取表达荧光素酶的MCF-7细胞，接种于24孔板，接种密度为2×104/孔。细胞接种后1～7d，每天胰蛋白酶消化其中3孔细胞，用细胞计数仪测定细胞数。以细胞生长天数为横坐标，细胞数目为纵坐标，分别绘制两种细胞生长曲线。

二．动物模型

BLAB/c裸鼠皮下移植瘤模型的建立BLAB/cnu/nu裸鼠，4～5周龄，体重（15±2）g，雌雄各3只。取对数生长期的MCF-7用PBS重悬为2．5×10/ml悬液，每只裸鼠左右背侧近腋部皮下接种100μl，共接种6只。接种后第5d采用德国BERTHOLD公司的活体成像系统检测信号强度。以后每5d观测一连续观测30d。观测前每只裸鼠戊巴比妥钠麻醉（计量为：35mg/kg体重），按150mg/kg体重的量腹腔注射luciferin（invivograde），10min后，进行活体成像观察皮下肿瘤的生长情况，定量分析各时间点的荧光值。绘制肿瘤皮下生长曲线.

MCF-7-luc细胞裸鼠皮下移植瘤的病理形态学观察

MCF-7-luc细胞裸鼠皮下接种后25d，脱颈处小鼠，取肿瘤组织，制成石蜡切片，切片厚度为3μm，经HE染色后观察细胞的病理形态学。

活体动物成像技术是近期发展起来的一种新型稳定可靠,是检测动物体内分子及细胞事件的影像检测技术，强有力手段。利用生物发光成像（BLI）可以对活体病灶的大小进行无损伤直观准确检测。

我们有自己的独立有机合成实验室，可以生产合成各种化学发光试剂，我们可以提供化学发光试剂、化学发光底物、发光标记物、发光增强剂、染料探针类、微生物和酶的显色底物以及体外诊断试剂。