吖啶橙染色常见问题-吖啶橙染色注意事项

AO/EB染色原理是AO能嵌入细胞核DNA发出绿色荧光，EB只能嵌入受损细胞核DNA发出橘红色荧光。

AO/EB染色是一种常用的细胞染色方法，用于评估细胞的生存状态和细胞膜完整性。AO（吖啶橙）和EB（溴乙锭）是两种荧光染料，在细胞中的行为有所不同。AO能够通过细胞膜进入细胞核，并与DNA结合，形成AO-DNA复合物，发出明亮的绿色荧光。这是因为AO能够穿过完整的细胞膜，并嵌入到细胞核DNA中。而EB只能通过受损的细胞膜进入细胞核，并与DNA结合，形成EB-DNA复合物，发出橘红色荧光。

核酸电泳染色剂有哪些

荧光显微镜下观察：凋亡细胞体积缩小，呈现核固缩，沿核膜呈点状、新月状或杆状，镜下可见四种细胞形态：活细胞，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞，核染色质着绿色但呈固缩状；非凋亡的亡细胞，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞，核染色质着橘红色但呈固缩状。因为有早期凋亡（绿色）和晚期凋亡细胞（橘红色）！

吖啶橙染色的叶绿体和细胞核颜色分别是什么

电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂：

1、溴化乙锭（ethidium bromide, EB）

最常用的核酸荧光染料，可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。 EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶 浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这 样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。

在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了 核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光 易分解，应于4℃避光保存，

2、吖啶橙（acridine orange, AO）：

吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发 下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在 22℃，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。

3、银（Ag+）试剂：

Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及 RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的 RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA 片段回收的制备。

4、亚甲蓝（methylene blue）

可将RNA染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长。染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用净水洗5~8h（反复换水），带型肉眼可见，最低检测量为 250ng。

怎么确定获得的叶绿体沉淀中还混有细胞核

叶绿体发出桔红色荧光,细胞核可发出绿色荧光。根据查询公开信息显示，吖啶橙是一种荧光色素,与细胞中 DNA 和 RNA 结合量存在差别,可发出不同颜色的荧光(即着色特异性),这是由于DNA是个高度聚合物,吸收荧光物质的位置较少,发绿色荧光,而RNA 聚合度低,能和荧光物质结合的位置多,故发红色荧光。

吖啶橙的主要用途

1、首先在叶绿体沉淀中加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧色。

2、其次当叶绿体沉淀的重量超过制定标准时，就证明叶绿体沉淀中有细胞核。

3、最后通过显微镜查看叶绿体沉淀即可。

用作荧光指示剂，肿瘤细胞及细菌、核酸染色剂及移码突变的诱变剂。

吖啶橙是一种荧光色素，吖啶橙激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。吖啶橙与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。