吖啶橙染色步骤详解-吖啶橙染色剂

2024-11-01 01:25:35

吖啶橙染色步骤详解-吖啶橙染色剂

1、首先在叶绿体沉淀中加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧色。

2、其次当叶绿体沉淀的重量超过制定标准时，就证明叶绿体沉淀中有细胞核。

3、最后通过显微镜查看叶绿体沉淀即可。

核酸电泳染色剂有哪些

常用的核酸染料有:

1、EB染料

EB属于核酸分子嵌入剂，通常用于分子遗传学、DNA和染色质结构分析等研究中，特别是国内很多实验室仍在使用EB进行凝胶核酸电泳实验的染色。

EB是极易渗透细胞膜与胞内DNA嵌合的小分子，它具有平面共轭大环结构，是典型的DNA

分子插入试剂，菲啶环插入到DNA分子的碱基对之间，与DNA嵌合形成稳定的复合物，并影响DNA

的复制，破坏正常的遗传生理现象。EB作为诱变性的化合物，它在人体中诱导突变的机制是不可逆转的。

2、GoldView染料

GoldView(GV)是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于RNA染色。

实质上，所谓的Goldview就是吖啶橙，也就是传说中的AO，有一种传统的细胞凋亡试验，采用的染料正是吖啶橙，也就是AO/EB染色试验，EB无法穿透完整的细胞膜，而AO可以穿过细胞膜染上细胞核，以此来区分凋亡和未凋亡的细胞。

3、GelRed 和 GelGreen染料

GelRed

和GelGreen

是两种集高灵敏、低毒性和超稳定于一身的极佳的荧光核酸凝胶染色试剂。其水溶染色剂通过美国环保局安全认定，废弃物可直接倒入下水道，而不会造成任何环境污染。

GelRed

和 GelGreen

的特殊化学结构使其难以穿透细胞膜进入细胞，正是这一特性降低了染料的细胞毒性。不过也正是因为如此，其价格大约是GoldView的十倍左右。

扩展资料

核酸染料的科研应用：

1、免疫分析

荧光标记的单克隆抗体技术为流式细胞仪在研究细胞膜和细胞内各种功能性抗原、肿瘤基因蛋白等领域扩展了无限的应用空间。

荧光探针可以通过蛋白质交联剂共价结合在单克隆抗体上。免疫荧光标记最常用的染料有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻红蛋白（PE）以及AlexaFluor系列染料等。

2、核酸检测

核酸荧光染料对细胞核染色后定量测量细胞所发出的荧光强度，就可以确定细胞核中DNA、RNA的含量，并可以对细胞周期和细胞的增殖状况进行分析。

有多种荧光染料可以对细胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst 33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。

百度百科-荧光染料

荧光显微镜下观察细胞，用什么染色方法？具体染色步骤是什么？有没有PA染色？谢谢！

电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂：

1、溴化乙锭（ethidium bromide, EB）

最常用的核酸荧光染料，可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。 EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。

在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光易分解，应于4℃避光保存，

2、吖啶橙（acridine orange, AO）：

吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在 22℃，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。

3、银（Ag+）试剂：

Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及 RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的 RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA 片段回收的制备。

4、亚甲蓝（methylene blue）

可将RNA染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长。染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用净水洗5~8h（反复换水），带型肉眼可见，最低检测量为 250ng。

染色体显带技术的分述

细胞内溶酶体和线粒体的荧光活体染色

Lyso-Tracker Red是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(Neutral?Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。

Mito-Tracker Green是一种线粒体(mitochondria)绿色荧光探针，可以用于活细胞线粒体特异性荧光染色。?Mito-Tracker?Green为采用Molecular?Probes公司的carbocyanine进行了荧光标记的一种Mito-Tracker，分子量为671.88，可以用作线粒体特异性的荧光探针。和rhodamine?123或JC-1相比，Mito-Tracker Green对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位。

Lyso-Tracker Red工作液的配制：

a. 取少量Lyso-Tracker Red按照1:13333-1:20000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中，使最终浓度为50-75nM。例如取1μl Lyso-Tracker Red加入到20ml13.33ml细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中。

2. 溶酶体的荧光标记：

a. 去除细胞培养液，加入步骤1配制好的并28℃预温育的Lyso-Tracker Red染色工作液，与细胞28℃共孵育30分钟。

b. 去除Lyso-Tracker Red染色工作液，加入新鲜的细胞培养液。

c. 随后通常用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到溶酶体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Lyso-Tracker Red染色工作液中Lyso-Tracker Red的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。

2. Mito-Tracker Green工作液的配制：

a. 取少量1mM Mito-Tracker Green储存液按照1:5000-1:50000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中，使最终浓度为20-200nM。例如取1μl Mito-Tracker Green加入到50ml或5ml细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中。混匀后即为Mito-Tracker Green工作液。HBSS with Ca2+ & Mg2+ (C0219) 可以向碧云天订购。

b. Mito-Tracker Green工作液使用前需28℃预温育。

注：工作液中Mito-Tracker Green的浓度可以根据实际情况进行适当调整。为降低背景，在染色效果可以接受的范围内，建议尽量使用较低浓度的Mito-Tracker Green。

3. 线粒体的荧光标记：

a. 去除细胞培养液，加入步骤2配制好的并28℃预温育的Mito-Tracker Green染色工作液，与细胞28℃共孵育15-45分钟。

b. 去除Mito-Tracker Green染色工作液，加入28℃预温育的新鲜细胞培养液。

c. 随后通常用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。此时可观察到线粒体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Mito-Tracker Green染色工作液中Mito-Tracker Green的浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。

吖啶橙染色的叶绿体和细胞核颜色分别是什么

染色体显带技术：Q带、G带、R带、C带、T带、N带，各带的染色试剂以及在染色体上所呈现的区带特征如下：

Q带：喹吖因荧光染色技术，显示中期染色体经氮芥因喹吖染色以后，在紫外线照射下所呈现的亮带和暗带，一般富含AT碱基的DNA区段表现为亮带，富含GC碱基的区带表现为暗带。

G带：Giemsa带，将中期染色体制片经胰酶或碱、尿素、去污剂等处理后再用Giemsa进行染色后所呈现的染色体区带，一般与Q带相符；

R带：中期染色体经磷酸盐缓冲液保湿处理，以吖啶橙或Giemsa染色，显示与G带明暗相间带型正好相反，所以又称反带；

C带：主要显示丝粒结构异染色质以及其它染色体区段的异染色质部分

T带：又称末端带，是染色体端粒部分经吖啶橙染色后所呈现的区带

N带：又称Ag-As染色法，主要用于核仁组织区的酸性蛋白质染色

关于细胞生物学实验的问题！！！！

叶绿体发出桔红色荧光,细胞核可发出绿色荧光。根据查询公开信息显示，吖啶橙是一种荧光色素,与细胞中 DNA 和 RNA 结合量存在差别,可发出不同颜色的荧光(即着色特异性),这是由于DNA是个高度聚合物,吸收荧光物质的位置较少,发绿色荧光,而RNA 聚合度低,能和荧光物质结合的位置多,故发红色荧光。

实验、叶绿体的分离与荧光观察

实验目的

1. 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。

2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。

实验原理

将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间, 有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。

实验用品

一、器材

1.主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。

2.小型器材: 500ml烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。

二、材料新鲜菠菜。

三、试剂 0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。

实验方法

一、叶绿体的分离与观察

1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。

2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3~5min。

3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。

4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。

5. 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即不叶绿体(混有部分细胞核)。

6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮、

7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。

(1)在普通光镜下观察。

(2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。

(3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。

二、菠菜叶手切片观察

用剔须刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。

(1)在普通光镜下观察。

(2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。

(3) 观察间接荧光：向手切片上滴加1～2滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液, 加盖片后可在荧光显微镜下观察间接荧光。

实验结果

一、叶绿体的分离和观察

1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。

2. 以Olympus荧光显微镜为例，在先用B(bule)激发滤片、B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。

3. 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。

二、菠菜叶手切片观察

1. 在普通光镜下可以看到三种细胞 (1)表皮细胞: 为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞; (2)保卫细胞: 为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3)叶肉细胞: 为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。

2. 在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱, 气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。

3. 用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光, 气孔仍为绿色。

作业

1. 在普通光学显微镜下，用目微尺和台微尺测量一下叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。

2. 在荧光显微镜下，观察叶绿体的自发荧光时，更换滤镜系统，叶绿体的颜色是否有变化？

实验五、植物染色体标本制备与观察

实验目的

学习植物染色体标本的制备技术，了解Feulgen反应的基本原理,学习其操作方法和压片法,初步掌握细胞分裂各期的主要特点.

核酸是生物最重要的组成成分,核酸分为两大类,即脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA).它们在细胞内的分布及化学性质均有所不同.DNA主要分布在核的染色质或有丝分裂过程中出现的染色体内.RNA分布在细胞质和核仁内.但在染色质及染色体中也含有少量的RNA,核仁中也有少量的DNA.在线粒体,叶绿体等细胞器内除含有RNA外,也含有少量的DNA.

实验原理

Feulgen反应的原理是根据DNA经弱酸(1mol/L)水解后,打开料嘌呤和脱氧核糖连接的键,在脱氧核糖的一端形成有离的醛基.这些醛基就在原位与Schiff试剂结合,形成含醌基( )的化合物,醛基是一个发色团所以具有颜色,因此凡有DNA的部位,就呈现紫红色.

实验材料

大麦、黑麦或小麦种子

实验内容

植物染色体标本的制备及DNA的显示法-Feulgen反应

压片法

细胞有丝分裂相的观察

实验步骤

（一）植物染色体标本的制备

1、将植物种子放在潮湿的滤纸上，20°C发芽，待胚根长至1～2cm时，切取0.5cm长的根尖部分。

2、预处理：将切下的根尖浸入0.1%秋水酰素液中，室温下处理3～4小时。

3、固定、水解及染色：

Camoy固定剂

固定10-30分钟 ? 95%酒精10分钟 ? 70%酒精10分钟 ? 蒸馏水 →(对照) 5%三氯醋酸 ? 90oC 15分钟

1mol/L HCl ← 蒸馏水 ? 1mol/L HCl ? 60 oC 8分钟 ? Schiff试剂40 -60分钟 ? 亚硫酸水(1,2,3) ? 换3次,每次5分钟自来水 ? 将染色后的根尖漂洗干净,悬着染色效果好的材料 ? 蒸馏水 ? 压片 ? 镜检

(二) 压片法

压片的操作步骤如下,把根尖放在载片上,用刀片切取根尖(0.3cm),纵切根尖,加一滴水,用解剖针将根尖纵向分成若干小条,保留1-2小条,加盖玻片,用铅笔端轻轻敲击盖玻片,使细胞分离,压平呈云雾状.

（三）蚕豆(或洋葱)根尖压片的观察

首先在低倍镜下,区分根尖的分生组织区及延长组织区的细胞,然后,在高倍镜下,观察细胞核的形态,注意在你的片子上,是否有有丝分裂细胞,如有,你能找到细胞分裂期的几个阶段,其特征如何 (可参照附录)

做Feulgen反应时,应注意的几个问题

固定剂的选择:一般常选用Carnoy固定液.其他的固定剂如Flemming固定剂及Champy固定剂等均可用,但不能使用Bouin固定剂.

水解时间:水解时间一定要合适,不宜过长或不足,否则会影响实验结果.如用Carnoy固定液固定的材料,水解时间一般在8-15分钟之间.水解时间的长短要随不同的材料及不同的固定剂而定.

Schiff试剂的质量:在做Feulgen反应时,重要的因素就是Schiff试剂的质量问题.实验时,要注意试剂颜色是否正常,有无SO2的气味.

洗涤剂的重要性:漂洗时,所用的亚硫酸水,最好在每次实验前临时配制,以便保持较浓的SO2.

实验对照组:一定要做对照片,以便说明实验结果的真实性.

操作过程中,用镊子镊取根尖的生长区部位,切勿夹取根冠部位.

鸦片过程中尽量使根尖分生组织细胞保持原来的分布状态.

习题

简述Feulgen反应的原理

欲得到一张好的Feulgen反应制片,制片过程中应注意些什么

绘制细胞分裂图。

实验六植物原生质体的制备

实验目的

1.学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体的形态。

2.学习植物原生质体的融合技术，观察不同方法融合细胞的形态及变化。

实验用品

显微镜，擦镜纸，剪子，镊子，小平皿，吸管四支，直式漏斗，300目尼龙网，10ml离心管，载片，盖片。

实验原理

原生质体（protoplast）这个术语最早是由Hanstein在1880年提出来的。确切地说，食用菌原生质体是指细胞壁完全消除后余下的那部分包裹的裸露的细胞结构。

植物的花瓣细胞在经过纤维素酶，离折酶处理后，纤维素和果胶成分遭到破坏，造成原生质体脱离细胞壁进入培养液中。

植物花瓣细胞中的大液泡中存在有大量色素，且不同的细胞色素不同，因此可以在不对细胞染色的情况下，通过颜色范围辨认不同细胞的原生质体，以及同种间细胞融合和异种间细胞融合情况。

PEG是一种高分子化合物，由于含有醚键而具有负极性，与水，蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连，在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合，高Ca2+高pH清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。

实验试剂

1.洗涤液：

甘露醇 0.6 M

CaCl2?2H2O 8 mM

NaH2PO4?H2O 2 Mm

Ph 5.6

实验步骤

1.酶液的制备把纤维素酶（EAS－867）溶于0.5～0.7摩尔/升甘露醇内，加10毫摩/升氯化钙溶液作稳定剂。酶溶解后，经4000转/分离心机沉降原生质体，20分钟后，取上清液。经针筒型过滤器，再经0.45微米微孔滤膜过滤后，在无菌箱内把酶液分装在三角烧瓶内，贮存在冰箱里备用。

2.材料准备把生长在温室，苗龄60天以上的烟草植株，取上中部全展叶，在日光下照射2小时，使它萎蔫。也可以用温室生长的蚕豆叶作同样处理，或用大田收获的胡萝卜，放在0℃以上低温备用。萎蔫后的叶片浸在3%的漂白精片溶液中15～20分钟，再用无菌水冲洗干净，用无菌吸水纸吸干表面水分。

3.酶解用尖头镊子撕去叶片下表皮，剪成小块。胡萝卜则用刀片削去表皮和中柱，取用皮层部，切成小块。以上材料1克，放入盛有10毫升酶溶液的培养皿里，加盖。在28～30℃下保温1.5～3小时。

4.洗涤叶片或其他组织经酶解后会出现圆形的游离原生质体，原生质体悬浮液内有未消化的组织、碎片、细胞和破裂的原生质体。用滤纸或尼龙布滤去粗杂质，再把原生质体悬浮液移到离心管，用手摇离心机转动2分钟，吸去上清液（见图），再加入0.5毫升甘露醇洗涤2～3次，最后就得到较为纯净的原生质体，可以供进一步培养或作其他实验用。

实验七细胞融合方法

实验目的

1、初步掌握动物细胞PEG融合的方法。

2、学习细胞融合及其应用的有关知识。

实验原理

2个或2个以上的细胞合并为1个细胞的现象，称为细胞融合。细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇（PEG）法和电融合方法。

用PEG处理细胞，能使质膜性质发生改变，导致细胞膜融汇，胞质流通，最后导致细胞融合。

实验器材、材料与试剂

1、仪器：

光学显微镜，离心机，恒温水浴锅，C02培养箱，超净台，倒置显微镜等。

2、材料

新鲜鸡红细胞，无菌注射器，6号针头，刻度离心管，试管，载玻片，盖玻片。