叶绿体吖啶橙染色荧光的作用-叶绿体染色剂

一. 实验原理

1.组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

2. 应用显微镜的成像原理，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，得出细胞的大小。

二.试剂与器械

1. 器材 : 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。

2. 试剂: 0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。

三. 实验步骤

（一）叶绿体的分离与观察

1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml

0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。

2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3-5min。

3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。

4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。

5. 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体

(混有部分细胞核)。

6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。

7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。

DNA和RNA的三个最主要的区别

1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。

2. 以Olympus荧光显微镜为例，在先用B(bule)激发滤片、B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。

3. 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。

二、菠菜叶手切片观察

1. 在普通光镜下可以看到三种细胞 (1)表皮细胞: 为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞; (2)保卫细胞: 为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3)叶肉细胞: 为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。

2. 在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱, 气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。

3. 用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光, 气孔仍为绿色。

RNA与DNA最重要的区别一是RNA只有一条链，二是它的碱基组成与DNA的不同，RNA没有碱基T（胸腺嘧啶），而有碱基U（尿嘧啶）。所以导致他们有以下性质上的不同。

1.两性解离：DNA无，只有酸解离，碱基被屏蔽（在分子内部形成了H键）。RNA有，有PI。

2.粘度大：DNA;RNA，粘度由分子长度/直径决定，DNA为线状分子，RNA为线团。

3.碱的作用：DNA耐碱RNA易被碱水解。

4.显色反应：

鉴别DNA和RNA+浓HCl RNA ------→ 绿色化合物

DNA ------→ 蓝紫色化合物苔黑酚

二苯胺啡啶溴红（荧光染料）和溴嘧啶都可对DNA染色，原理是卡在分子中，DNA的离心和电泳显色可用它们。

DNA和RNA的鉴别染色

利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果，但该方法已被许多实验室广泛采用。

5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇，因此，常用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而RNA不溶，故可用苯酚来沉淀RNA。

6.紫外吸收：核酸的λm＝260nm，碱基展开程度越大，紫外吸收就越厉害。当A＝1时，DNA：50ug/ml，RNA和单链DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。用A260/A280还可来表示核酸的纯度。

7.沉降速度：对于拓扑异构体（核苷酸数目相同的核酸），其沉降速度从达到小依次为：RNA ; 超螺旋DNA > 解链环状DNA ; 松弛环状DNA ; 线形DNA也就是在离心管中最上层是线形DNA，最下面是RNA。

8.电泳：核苷酸、核酸均可以进行电泳，泳动速度主要由分子大小来决定，因此，电泳是测定核酸分子量的好方法。

9.DNA分子量测定最直接的方法：用适当浓度的EB（溴嘧啶）染色DNA，可以将其他形式的DNA变成线形DNA，用电镜测出其长度，按B-DNA模型算出bp数，根据核苷酸的平均分子量就可计算出DNA的分子量。