吖啶橙荧光染色法-吖啶橙染色液

2024-11-18 15:57:24

吖啶橙荧光染色法-吖啶橙染色液

甲醛变性凝胶电泳并不能区分相相同大小的ssDNA和ssRNA.因为二者长度一致，在凝胶中泳动速率也一致。

目前有可分离ssRNA和ssDNA的技术，我只是看过一个设想，但没有后续的实验报道。即使用纯化的SSB蛋白（就是单链DNA结合蛋白，其体内功能是DNA复制时结合解旋酶解开而成的单链DNA，防止复性）作为亲和柱固相，亲和层析DNA/RNA溶液，由于SSB能够特异性的结合ssDNA，因此能够分离ssDNA和ssRNA。

此外，如果不要求得率的话，直接用RNaseI处理即可获得ssDNA。

吖啶橙染色原理

1.白细胞计数与分类

早期有过敏反应的患者白细胞总数与嗜酸性粒细胞增加，前者大多在（10～20）×10/L之间，后者在20%以上。如有细菌继发感染除白细胞总数增加外中性粒细胞亦显著增加。

2.血液微丝蚴的发现

丝虫病的确诊有赖于微丝蚴的发现，通常采用外周血液的检查，大多自夜10时至次晨2时微丝蚴最易找到，如夜间血中超出150条/60μl，白昼亦可找到。

（1）鲜血法用血红蛋白计吸管吸取耳垂血20μl，在低倍显微镜下找微丝蚴。阳性者可见微丝蚴自由摆动，前后卷曲，颇为活跃。

（2）涂片法耳垂取血三大滴（约等于60μl）置于玻片中心，涂成厚薄均匀边缘整齐的长方形或椭圆形厚血片约2cm×3cm大小自20世纪80年代起，又统一规定为120μl即六大滴双片法。染色可用品蓝或硼砂亚甲蓝染色法如鉴别虫种有困难时可用吉姆萨或苏木精染色。采用荧光色素吖啶橙染色法，亦可提高微丝蚴检出率。

（3）浓集法微丝蚴的浓集法很多都是将血液内的红细胞溶解后，离心沉淀吸取沉渣寻找被集中在沉渣内的微丝蚴。常用的溶血剂为蒸馏水。

（4）微孔膜过滤法用含有5%枸橼酸钠0.1ml的10ml注射器抽血1m1混匀，再吸10%teepol液9ml（或2%吐温80液或0.1%碳酸氢钠液）混匀溶血，将注射器接25mm直径的5μm孔径微孔膜过滤器，溶血液通过薄膜滤下，微丝蚴留于薄膜上，取下薄膜用0.1%苏木精或0.1%亚甲蓝染色后镜检。

（5）微丝蚴白天诱出法在白天口服乙胺嗪100mg后1小时内微丝蚴可以在外周血液内查到。本法不宜作普查丝虫病的方法。在门诊检查，可作参考。

3.各种体液微丝蚴检查

鞘膜积液、乳糜尿、淋巴或乳糜腹水、心包积液、眼前房水等液体中检查微丝蚴，可用直接涂片、染色镜检或离心浓集法检查

4.免疫学诊断

目前国内外常用的免疫学诊断方法有：

（1）皮内试验注射犬恶丝虫抗原0.05ml于受试者前臂皮内，15min后丘疹超过0.9cm者为阳性。此试验与丝虫病患者体征符合率为73.6%～96.6%，与血中带微丝蚴阳性符合率为86.2%～94.1%，但与血吸虫病可产生轻度交叉反应本法只具过筛及辅助诊断价值，在防治后期也不宜用于监测。

（2）间接免疫荧光抗体试验以长爪沙鼠等动物模型收集的成虫和微丝蚴作抗原，荧光抗体采用羊抗人IgG荧光抗体结合物，具有高度敏感性和特异性。以成虫切片作抗原，其敏感性为92%～98%，特异性为95%；以微丝蚴切片作抗原，敏感性达92%～96%特异性为98%。本法可作为丝虫病辅助诊断和血清流行病学调查与现场监测。缺点仍是不能用于疗效考核，及区别患者属于既往感染或活动感染。

（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）采用马来丝虫、犬恶丝虫、指状腹腔丝虫及微丝蚴等可溶性抗原，ELISA测定抗体，与丝虫病患者的阳性符合率为85%～100%，假阳性反应为1.5%～8.2%。用微丝蚴或成虫ES抗原对微丝蚴血症者阳性符合率为93%～95%，非流行区健康人及肠道线虫感染者均为阴性反应。本法检测人体丝虫病抗体，具有较高特异性和敏感性，适用于现场调查同样本法不能用于疗效考核及区别患者是否为活动性感染

（4）检测循环抗原WHO推荐应用免疫色谱技术（ICT）测试卡检测班氏丝虫抗原。据报告该法敏感性为90%～98%，特异性达99%～100%。

用单克隆抗体酶联免疫吸附试验（McAbELISA）和斑点酶联法（Dot－ELISA）检测丝虫病患者血清中抗原，特异性分别为94%和96%，Dot－ELISA可检出0.055μg/L抗原，而McAbELISA仅能检出10μg/L抗原。两者均能检出活动性感染作为丝虫病防治的后期监测、搜索残存传染源和评价防治效果。

5.分子杂交及DNA重组技术

目前基因克隆和DNA技术正应用于丝虫病诊断，具有很高的敏感性和特异性。

6.乳糜尿与淋巴尿

乳糜尿与淋巴尿，前者呈乳白色，可用提取，以苏丹Ⅲ染色，在显微镜下可见红**油点淋巴尿的肉眼检查与正常尿无异，其含量以蛋白质为主，也有少数红细胞，但无管型。自鞘膜积液穿刺而得的乳糜液与淋巴液，与乳糜尿及淋巴尿大致相同，自其沉淀中可发现活动的微丝蚴。

7.活组织检查

将疑似的病变组织，如下肢浅表淋巴结、附睾结节切取小块，进行病理检查，可找到成虫及可见相关的病理变化。

8.其他辅助检查

淋巴管造影：丝虫病患者常显示扩张的输入淋巴管和狭小的输出淋巴管，淋巴结实质显影有缺损现象。