吖啶橙染色浓度选择-吖啶橙染色常见问题

荧光特性、结合dna。

1、荧光特性：吖啶橙具有荧光特性，当被细胞或组织吸收后，可以在特定的波长下发出荧光。

2、结合dna：吖啶橙可以与细胞中的dna结合，形成带有荧光的dna吖啶橙复合物。

ao/eb染色原理

叶绿体足植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作川就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。实验目的一、通过植物细胞叶绿体的分离。了解细胞器分离的一般原理和方法。二．观察叶绿体的自发荧光和次生荧光．井熟悉荧光显微镜的使用方法。实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差迷离心，是分离细胞器的常用方法，一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗 粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4moJ/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5mia，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荣光．若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿索的火红色荧光和水质素的**荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片，益玻片和无荧光油。实验用品一、器材1、主要设备：普通离心机、组织捣碎机，粗天平、荧光显微镜。2、小型器材，500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。二、材料 新鲜菠菜三、试剂 0.35mol/L氯化钠溶O.01%吖啶橙(acridine orange)。实验方法1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml0.35mol/L NaCI溶液中，装入组织捣碎机。2、利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆3—5min。3、将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。4、取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。5、将上沾液在3000r/min下离心5rmin．弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞陔)。6、将沉淀用0.35mol/LNaCI溶液悬浮。7、取叶绿体悬液一消滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 ①在普通光镜下观察。

②在荧光显微镜下观察。

③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再漓加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可以荧光显微镜下观察。菠菜叶手切片观察 用剖须刀将新鲜的嫩菠菜切削一斜面置于载片上，滴加1--2滴0.35mol/LNaCI溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。 ①在普通光镜下观察。

②在荧光显微镜下观察。

③用同样方法制片，但滴加I--2滴0.01%吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加盖廾后即町以荧光显微镜下观察。实验结果一、叶绿体的分离和观察1、普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2、以Olympus荧光显微镜为例，在选用B(blue)激发滤片，B双色镜和O530(orange)阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。3、加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧色。二、菠菜叶手切片观察1、在普通光镜下可以看到三种细胞(1)表面细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。

(2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。

(3)叶肉细胞：为排成栅状的长方形和椭幽形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。2、在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。3、用吖啶橙染色后，叶绿体则发出枯红色荧光，细胞核町发出绿色荧光，气孔仍为绿色。附件列表

吖啶橙的主要用途

AO/EB染色原理是AO能嵌入细胞核DNA发出绿色荧光，EB只能嵌入受损细胞核DNA发出橘红色荧光。

AO/EB染色是一种常用的细胞染色方法，用于评估细胞的生存状态和细胞膜完整性。AO（吖啶橙）和EB（溴乙锭）是两种荧光染料，在细胞中的行为有所不同。AO能够通过细胞膜进入细胞核，并与DNA结合，形成AO-DNA复合物，发出明亮的绿色荧光。这是因为AO能够穿过完整的细胞膜，并嵌入到细胞核DNA中。而EB只能通过受损的细胞膜进入细胞核，并与DNA结合，形成EB-DNA复合物，发出橘红色荧光。

核酸染色剂会不会影响marker条带

用作荧光指示剂，肿瘤细胞及细菌、核酸染色剂及移码突变的诱变剂。

吖啶橙是一种荧光色素，吖啶橙激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。吖啶橙与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。

淋巴丝虫病的检查

1、溴化乙锭（ethidium bromide,EB）

最常用的核酸荧光染料,可嵌入核酸双链的配对碱基之间,在紫外线激发下,发出桔红色荧光.EB-DNA复合物中的EB发出的荧光,比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍,因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型.若EB背景太深,可将凝胶 浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min,使非结合的EB褪色,这 样可检查到10ng的DNA样品,EB也可用于检测单链DNA或RNA,但其对单链核酸的亲和力相对较小,荧光产率也相对较低.

在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB,染色可在电泳过程中进行,能随时观察核酸的迁移情况.但EB带正电荷,嵌入碱基后增加了 核酸分子的刚性,使迁移率减慢,故不宜用于测定核酸分子量的大小,这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色.EB见光 易分解,应于4℃避光保存,

2、吖啶橙（acridine orange,AO）：

吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间,在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合,在254nm紫外线激发 下产生640nm的红色荧光.因此可区分单链和双链核酸,灵敏度分别为0.1μg和0.05μg.但吖啶橙的染色操作要求严格,应在 22℃,0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min,然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时.

3、银（Ag+）试剂：

Ag+与核酸形成稳定复合物,然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒.AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链,双链DNA及 RNA都染成黑褐色.银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右,比亚甲蓝染色高100~1000倍,在小于0.5mm厚的凝胶中,能检测出0.5ng的 RNA,其缺点是专一性不强,能与蛋白质,去污剂反应也产生褐色,而且对DNA的染色定量不准确.银与DNA稳定结合,对DNA有破坏作用,不适于DNA 片段回收的制备.

4、亚甲蓝（methylene blue）

可将RNA染成蓝色,但灵敏度不高,而且操作时间长.胶浸泡于0.02%的亚甲蓝,10mmol/L Tris-Ac（pH8.3）,4℃放置1~2h,用净水洗5~8h（反复换水）,带型肉眼可见,最低检测量为 250ng.

1.白细胞计数与分类

早期有过敏反应的患者白细胞总数与嗜酸性粒细胞增加，前者大多在（10～20）×10/L之间，后者在20%以上。如有细菌继发感染除白细胞总数增加外中性粒细胞亦显著增加。

2.血液微丝蚴的发现

丝虫病的确诊有赖于微丝蚴的发现，通常采用外周血液的检查，大多自夜10时至次晨2时微丝蚴最易找到，如夜间血中超出150条/60μl，白昼亦可找到。

（1）鲜血法用血红蛋白计吸管吸取耳垂血20μl，在低倍显微镜下找微丝蚴。阳性者可见微丝蚴自由摆动，前后卷曲，颇为活跃。

（2）涂片法耳垂取血三大滴（约等于60μl）置于玻片中心，涂成厚薄均匀边缘整齐的长方形或椭圆形厚血片约2cm×3cm大小自20世纪80年代起，又统一规定为120μl即六大滴双片法。染色可用品蓝或硼砂亚甲蓝染色法如鉴别虫种有困难时可用吉姆萨或苏木精染色。采用荧光色素吖啶橙染色法，亦可提高微丝蚴检出率。

（3）浓集法微丝蚴的浓集法很多都是将血液内的红细胞溶解后，离心沉淀吸取沉渣寻找被集中在沉渣内的微丝蚴。常用的溶血剂为蒸馏水。

（4）微孔膜过滤法用含有5%枸橼酸钠0.1ml的10ml注射器抽血1m1混匀，再吸10%teepol液9ml（或2%吐温80液或0.1%碳酸氢钠液）混匀溶血，将注射器接25mm直径的5μm孔径微孔膜过滤器，溶血液通过薄膜滤下，微丝蚴留于薄膜上，取下薄膜用0.1%苏木精或0.1%亚甲蓝染色后镜检。

（5）微丝蚴白天诱出法在白天口服乙胺嗪100mg后1小时内微丝蚴可以在外周血液内查到。本法不宜作普查丝虫病的方法。在门诊检查，可作参考。

3.各种体液微丝蚴检查

鞘膜积液、乳糜尿、淋巴或乳糜腹水、心包积液、眼前房水等液体中检查微丝蚴，可用直接涂片、染色镜检或离心浓集法检查

4.免疫学诊断

目前国内外常用的免疫学诊断方法有：

（1）皮内试验注射犬恶丝虫抗原0.05ml于受试者前臂皮内，15min后丘疹超过0.9cm者为阳性。此试验与丝虫病患者体征符合率为73.6%～96.6%，与血中带微丝蚴阳性符合率为86.2%～94.1%，但与血吸虫病可产生轻度交叉反应本法只具过筛及辅助诊断价值，在防治后期也不宜用于监测。

（2）间接免疫荧光抗体试验以长爪沙鼠等动物模型收集的成虫和微丝蚴作抗原，荧光抗体采用羊抗人IgG荧光抗体结合物，具有高度敏感性和特异性。以成虫切片作抗原，其敏感性为92%～98%，特异性为95%；以微丝蚴切片作抗原，敏感性达92%～96%特异性为98%。本法可作为丝虫病辅助诊断和血清流行病学调查与现场监测。缺点仍是不能用于疗效考核，及区别患者属于既往感染或活动感染。

（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）采用马来丝虫、犬恶丝虫、指状腹腔丝虫及微丝蚴等可溶性抗原，ELISA测定抗体，与丝虫病患者的阳性符合率为85%～100%，假阳性反应为1.5%～8.2%。用微丝蚴或成虫ES抗原对微丝蚴血症者阳性符合率为93%～95%，非流行区健康人及肠道线虫感染者均为阴性反应。本法检测人体丝虫病抗体，具有较高特异性和敏感性，适用于现场调查同样本法不能用于疗效考核及区别患者是否为活动性感染

（4）检测循环抗原WHO推荐应用免疫色谱技术（ICT）测试卡检测班氏丝虫抗原。据报告该法敏感性为90%～98%，特异性达99%～100%。

用单克隆抗体酶联免疫吸附试验（McAbELISA）和斑点酶联法（Dot－ELISA）检测丝虫病患者血清中抗原，特异性分别为94%和96%，Dot－ELISA可检出0.055μg/L抗原，而McAbELISA仅能检出10μg/L抗原。两者均能检出活动性感染作为丝虫病防治的后期监测、搜索残存传染源和评价防治效果。

5.分子杂交及DNA重组技术

目前基因克隆和DNA技术正应用于丝虫病诊断，具有很高的敏感性和特异性。

6.乳糜尿与淋巴尿

乳糜尿与淋巴尿，前者呈乳白色，可用提取，以苏丹Ⅲ染色，在显微镜下可见红**油点淋巴尿的肉眼检查与正常尿无异，其含量以蛋白质为主，也有少数红细胞，但无管型。自鞘膜积液穿刺而得的乳糜液与淋巴液，与乳糜尿及淋巴尿大致相同，自其沉淀中可发现活动的微丝蚴。

7.活组织检查

将疑似的病变组织，如下肢浅表淋巴结、附睾结节切取小块，进行病理检查，可找到成虫及可见相关的病理变化。

8.其他辅助检查

淋巴管造影：丝虫病患者常显示扩张的输入淋巴管和狭小的输出淋巴管，淋巴结实质显影有缺损现象。