吖啶橙荧光染色原理激发光-吖啶橙荧光染料进行细胞染色

2024-10-31 06:01:33

光镜无法分辨线粒体（光镜下看不到），同时线粒体不含有天然荧光分子如叶绿素，所以荧光显微镜也无法看到，都是透明的。你看不到在哪里。

吖啶橙能使DNA和RNA都染色，显示不同的荧光。DNA呈绿色，RNA呈红色。因为线粒体中含有DNA，所以在荧光镜下呈绿色。但是颜色不深，因为线粒体中DNA含量不高。

核酸电泳染色剂有哪些

用作荧光指示剂，肿瘤细胞及细菌、核酸染色剂及移码突变的诱变剂。

吖啶橙是一种荧光色素，吖啶橙激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。吖啶橙与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。

观察dna和rna在细胞中的分布

电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂：

1、溴化乙锭（ethidium bromide, EB）

最常用的核酸荧光染料，可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。 EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。

在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光易分解，应于4℃避光保存，

2、吖啶橙（acridine orange, AO）：

吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在 22℃，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。

3、银（Ag+）试剂：

Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及 RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的 RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA 片段回收的制备。

4、亚甲蓝（methylene blue）

可将RNA染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长。染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用净水洗5~8h（反复换水），带型肉眼可见，最低检测量为 250ng。

荧光具体的说是什么样子的？

观察dna和rna在细胞中的分布的回答如下：

观察DNA和RNA在细胞中的分布是一项重要的实验技术，通常使用染色技术来实现。以下是观察DNA和RNA在细胞中分布的一般步骤和拓展知识：

一般步骤：

收集细胞样本：选择适合的细胞样本，如人体或动物的器官组织，或者癌细胞系等。

细胞固定：将细胞样本固定在适当的缓冲液中，以停止细胞活动并保持细胞结构。

细胞包埋：将固定后的细胞样本包埋在石蜡或冰冻保护剂中，以便长期保存。

切片制备：将包埋的细胞样本切成薄片，以便在显微镜下观察。

染色：将切片用特定的染色剂染色，以便能够更清晰地观察DNA和RNA的分布。

观察：将染色后的切片放在显微镜下观察，通过不同波长的光线照射观察DNA和RNA的分布。

拓展知识：

核酸的基本结构：DNA和RNA都是核酸，它们都是由核苷酸组成的线性大分子。DNA由脱氧核糖核苷酸组成，而RNA由核糖核苷酸组成。

DNA和RNA的功能：DNA是细胞内遗传信息的载体，它包含了生物体遗传信息的所有信息。RNA是DNA表达的重要媒介，它可以从DNA中转录出蛋白质编码序列，并在蛋白质合成过程中起到关键作用。

染色剂的原理：在观察DNA和RNA的分布实验中，通常使用的染色剂包括荧光染料和吖啶橙等。这些染色剂可以与DNA或RNA特异性结合，并改变它们对光的吸收和发射特性，从而使它们的分布更加清晰可见。

实验注意事项：在实验过程中应该注意细胞样本的收集和固定，以及实验操作过程中的卫生问题。此外，染色剂的使用应该按照推荐的浓度和时间进行，避免过度染色或不足染色。

应用领域：观察DNA和RNA的分布实验在生物学、医学、遗传学等领域都有广泛的应用。例如，可以用于研究基因表达、癌症细胞的异常分裂增殖过程等。此外，还可以应用于法医学中的亲子鉴定等。

荧光染料与多少dna结合肉眼可见颜色变化

荧光从本质上说，是分子中的电子吸收光子的能量后，跃迁到较高的能级，当它从较高的能级再跃迁到原来的低能级的时候，就会发出一个光子，因为这个过程中有能量的损失，所以发出的光子比吸收的光子能量要低，波长要长。所以：

1、荧光物质都是吸收短波长的光而发出较长波长的光，比如DAPI吸收紫色光发出蓝色荧光，绿色荧光蛋白、FITC吸收蓝色光发出绿色荧光，CY3、PI吸收绿色光发出红色荧光，CY5吸收红色光发出波长为670纳米的红外线。

2、荧光必须是在有激发光照射的情况下才会有，如果激发光没了，荧光也马上停止。有些物质在外来激发光停掉后还能发出一段时间的微弱的光，那不是荧光，是磷光，跟荧光的本质是不一样的。

3、我们平时见到的好多现象其实并不是荧光，而被误以为是荧光。比如萤火虫的屁股其实是化学发光；手机屏幕和按键的背景光其实是发光二极管的光，来自于电；有些关了灯后还在亮的荧光壁画或者夜光手表发的也是磷光；演唱会上挥舞的棒棒还有荧光手镯是化学发光；那种弹性很好的小球，一震动就发光的那种，里面有一个电池，也是发光二极管。

碘化丙啶(propiolium iodide，PI)能嵌入DNA双螺旋中，可使荧光强度增加约20倍，以488nm波长激发，DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm。

小鼠Lewis肺癌细胞DNA含量测定方法

(1).从C57BL/6小鼠上切除肿块，在培养皿内用PBS冲洗。

(2).去除结缔组织及，剪碎肿块。

(3).小碎片移入1.20×38mm针,加压使其通过,于4℃条件下重悬细胞于HBSS中。

(4).将200～300μL细胞悬液(5×105细胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL)，染色3LL细胞，于4℃存放20～30分钟。

(5).测定580～750nm之间的发射荧光，以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。

注：PI染色液：0.1%柠檬酸钠1000mL+PI 5mg + 1% Nonide P40水。

2. 培养细胞DNA的流式细胞仪分析

(1).从培养皿中吸去培养基，以HBSS冲洗二次。

(2).加入PI5mL于培养皿中，在4℃放10分钟。

(3).用吸管反复次打细胞，使细胞破坏，胞核释放出来，再行流式细胞仪分析。