药典内毒素检测-原料药内毒素检测

一、非无菌原料药精制、干燥、粉碎、包装等生产操作的暴露环境应当按照D级洁净区的要求设置。

二、质量标准中有热原或细菌内毒素等检验项目的，厂房的设计应当特别注意防止微生物污染，根据产品的预定用途、工艺要求采取相应的控制措施。

三、质量控制实验室通常应当与生产区分开。当生产操作不影响检验结果的准确性，且检验操作对生产也无不利影响时，中间控制实验室可设在生产区内。

原料药GMP实验室设计（喜格）

玻璃酸钠注射液哪个厂家的好？

　[摘要] 目的：建立新药的细菌内毒素检查方法。方法：采用鲎试验检查法对新药中的细菌内毒素进行检查。结果：介绍了如何建立新药的细菌内毒素检查方法，重点是细菌内毒素检查限值的确认以及如何进行干扰试验。结论：细菌内毒素检查法为新药的质量控制以及应急检验提供了有益的基础。

[关键词] 新药；细菌内毒素检查法；干扰试验

[中图分类号] R927.12 [文献标识码] B [文章编号] 1673-7210（2011）11（b）-159-03

How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs

XIAO Guinan, SUN Qingping, SHENG Yingmei

Guangdong Institute for Drug Control in Guangdong Province, Guangzhou 510180, China

[Abstract] Objective: To establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs. Methods: Tachepleus amebocyte lysate test was applied to detect bacterial endotoxins in new drugs. Results: How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs was introduced, and especially focused on how to define the limit of bacterial endotoxins and carry out the interference test. Conclusion: Bacterial endotoxin test provides useful bases in quality control and emergency test for new drugs.

[Key words] New drugs; Bacterial endotoxin test; Interference test

新药以细菌内毒素检查方法代替既往的家兔热原检查法是一个趋势，在药害事件的应急处理中有一定的应用价值，这也符合国际上对动物实验的“3R”原则（优化、减少、替代）的要求。现行细菌内毒素检查方法是1968年美国科学家Levin和Bang所建立的鲎试验法[1]。从开展内毒素检查的现状来看，部分单位未能参照《中国药典》2011年版二部的要求进行实验和设计，本文着重介绍在建立新药细菌内毒素检查法中容易出现问题的细菌内毒素限值的确定及干扰试验这两个环节，力图为新药的质量控制以及应急检验提供有益的参考依据。

1 新药细菌内毒素检查限值的确认

1.1 细菌内毒素检查限值的计算公式

新药细菌内毒素检查限值（L）的确定是整个方法学建立的前提和基础，现在一般按照《中国药典》2011版二部附录XI E进行确定[2]。计算公式为L=K/M，K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg?h）表示，非放射性注射剂K=5 EU/（kg?h），放射性注射剂K=2.5 EU/（kg?h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg?h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，成人体重按60 kg计算，体表面积为1.62 m2。部分抗肿瘤药物及抗生素的使用剂量以体表面积描述时，可将每平方米体表面积剂量乘以0.027，即可转换为每千克体重剂量。

1.2 细菌内毒素检查限值的确认程序

首先根据所研究的新药品种说明书，通过查阅最新版《临床用药须知》等相关权威资料，得到人用每千克体重每小时的最大供试品剂量（M值）并求出L值，将所求得的L值与相关的质量标准（《美国药典》、《英国药典》、《日本药局方》、《欧洲药典》）以及国家食品药品监督管理局颁布的转正标准或注册标准散件中关于该品种的细菌内毒素限值进行参考对比。

还有一种方法是参考该品种的热原检查剂量（可视为M值），因为热原剂量的设置一般为成人临床用量的1～3倍，与常用的安全系数3～10倍较为接近，这种参考热原检查剂量的做法在以前颇为盛行，现在已逐渐少用。

1.3 细菌内毒素限值计算的常见误区

1.3.1 将成人日均用量误作最大用量 大多数情况下，说明书或资料往往只提供了某药的单次或每日用量，实践中不少人往往将单次用量误作最大用量进行限值计算，所得限值明显偏宽。众所周知，除极少数情况（急性、重症患者用药）下的单次用量可作为最大用量外，多数情况的日常用量换算成最大用量，还需考虑一定的安全系数（一般取3～10倍）。

1.3.2 误将每日总用量当成每次最大用量 只根据说明书或资料提供的某药的每日总用量，未考虑该药品总量的静脉滴注时间已经远不止1 h，这样求得的限值难于真实反映实际限值，因为M值是反映人用每千克体重每小时能接受的最大供试品剂量，而非全日的总用量。

1.3.3 对于大输液的细菌内毒素限值确定过于按部就班 没有考虑大输液的特殊要求，大输液的主药成分只占其中很少的一部分，实际多为葡萄糖注射液或生理盐水注射液，如果按主药成分计算细菌内毒素限值的话，容易偏宽，因而如无特殊情况一般将热原检查剂量10 ml/kg视为最大临床用量，将大输液细菌内毒素限值定为0.5 EU/ml。

1.3.4 忽视滴注时带入的外源性细菌内毒素 某些新药在临床使用时是溶于大输液进行滴注的。假设某抗生素药品的规格是1 g/支，其使用方法是溶于5%葡萄糖注射液250 ml，在1 h内滴注完毕。可参照下述方法计算该抗生素细菌内毒素限值，此时K=5 EU/（kg?h），因而60 kg的成人每小时体内可以接受细菌内毒素的最大量为300 EU，而在1 h内250 ml的5%葡萄糖注射液最大可带来125 EU的细菌内毒素，1 g的该药最多只能带入175 EU（125～300 EU）的细菌内毒素，因而该抗生素其细菌内毒素限值可定为0.175 EU/mg。如果按常规计算的话，求得限值为0.300 EU/mg。

1.3.5 没有考虑到主药外的其他成分 在细菌内毒素限值的确定过程中，特别是原料，要注意扣除主药外的其他成分（如金属离子：头孢噻肟钠中的钠，西司他丁钠中的钠），因为标准一般规定为每毫克中头孢噻肟或西司他丁所含的细菌内毒素量不得过多少EU，而制成的原料往往是含钠等其他成分的。

2 鲎试剂灵敏度复核试验

2.1 前期准备工作

试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，30 min以上）去除，部分物品也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法（如强酸强碱浸泡法），但需经过确证不干扰鲎试验检查。

2.2 灵敏度复核试验

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。需要注意的是，当实测灵敏度λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ～2.0λ，λ为鲎试剂灵敏度的标示值）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度，日常检验中部分检验者误将实测的灵敏度作为批鲎试剂的灵敏度来进行常规检查或干扰试验。

3 鲎试验检查的干扰试验

3.1 最大有效稀释倍数（MVD）的确认

MVD是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，计算公式为MVD=C?L/λ，式中L为供试品的内毒素限值，λ为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度；C为供试品液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0；如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L。

此处往往根据市售主要的鲎试剂灵敏度范围（0.03～1.00 EU/ml）来计算干扰试验中的有效浓度稀释范围。

3.2 干扰预试验

取本品1支（原料精密称取不低于10 mg的量），按照拟定内毒素限值，原料或注射用粉针加内毒素检查用水溶解并稀释至不超过MVD规定的系列浓度，注射液直接稀释至不超过最小有效稀释浓度的系列浓度，预试验时一般可取一个厂家灵敏度为0.125 EU/ml或0.250 EU/ml的鲎试剂，对供试品原液及其系列稀释液（供试品阴性对照，NPC）进行干扰检验，另外设立阳性对照（PC）、阴性对照（NC）、供试品阳性对照（PPC），每个浓度平行做两管，最终得出供试品（批号：20110802）在某浓度及以下浓度对鲎试验检查不产生干扰作用（PPC首次出现“++”的浓度）的结论。供试液的干扰预试验结果，见表1。

由表1可以看出，供试品在不高于20 mg/ml的浓度下不干扰鲎试验的检查。

3.3 正式干扰试验

按表2制备各系列溶液，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过MVD的溶液，参照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作，记录供试液的干扰情况。

只有当供试品溶液和阴性对照溶液的平行管都为阴性，且鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效，计算系列鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液和干扰试剂系列溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。当Es在0.5λ～2.0λ及Et在0.5Es～2.0Es时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。

当进行新药的内毒素检查试验前或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

4 排除供试液干扰的方法[3]

4.1 样品稀释法

选用较高灵敏度的鲎试剂，将供试品进一步稀释（低于最大有效稀释倍数）后进行干扰试验，一般情况下大部分的干扰作用均能得到有效控制。

4.2 调节pH法

测定供试液的pH值，若不在鲎试剂的有效缓冲pH范围（6.0～8.0），可选用一定浓度的HCl或NaOH将pH值调节至6.0～8.0，但要注意应进行方法学验证（干扰试验），确保不干扰鲎试验检查，且对内毒素检查结果无影响。

4.3 超滤法

通过专用超滤系统，将影响内毒素检查的药物小分子杂质滤除，内毒素则留存于滤器内，滤器内加入相应的内毒素检查用水进行检查，可在几乎不影响内毒素浓度的前提下尽量避免小分子药物的干扰作用。

4.4 其他方法

微温保持加热法；使用去G因子鲎试剂或厂家提供的专用抗增液对样品进行稀释（此时须进行干扰试验）。

5 常规检查

使用最大有效稀释倍数（MVD） 并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液供试品溶液和供试品阳性对照溶液，进行细菌内毒素的常规检测。

6 讨论

建立新药品种的细菌内毒素检查法，首先要结合临床最大用量确定其细菌内毒素限值，应用两个厂家的鲎试剂对3批样品进行鲎试验检查（普通凝胶法或动态浊度法定量试验），如结果能证实样品在不低于最大有效稀释浓度时对细菌内毒素检查无干扰作用，且样品的细菌内毒素常规检查结果为阴性，此时方可建立该品种的细菌内毒素检查法[4-7]。

根据临床最大用量规定及实验结果，将所研究的新药细菌内毒素限值定为每毫克主药（或每毫升）中含内毒素的量应小于若干EU。经干扰实验确证，该新药在某个浓度或低于该浓度时（但不低于最大有效稀释浓度MVC）对细菌内毒素检查无干扰作用。取本品3批，按拟定的标准检验，其内毒素检查结果均符合规定。

FDA对原料药的微生物限度有没有要求

玻璃酸钠，现在国内有这么几种品牌，施沛特，山东博士伦福瑞达 阿尔治，日本的中国代理 上海佰加壹，上海浩海！

规格有，2ml

2.5ml

价格 170元到250元吧！

衡量玻璃酸钠注射液的关键因素，是 分子量 和 内毒素 生产工艺水平

第一品牌是 施沛特 市场领导者地位 福瑞达公司也是全球最大的玻璃酸钠（也叫透明质酸）生产基地，研发基地！分子量150-250万（人体自身的玻璃酸钠是200万-300万）的内毒素检测标准是委托该公司制定的，检测技术也是该公司的专利。制备方法是微生物发酵方法！

第二的是 阿尔治，小日本的东西，分子量80万-120万，生物提取法工艺，价格贵的要，质量一般吧，赚中国人的钱！呵呵

下面的就是 上海佰加壹了 ，分子量80万以上，最高分子量大概不会过100万，生物提取法工艺，质量比较差了。

最差的是上海浩海，连分子量都不标注的，其他的就不用说了！

人体关节注射玻璃酸钠，2ml就可以了，多了也没有意义，这种药是高分子量要，不稳定容易降解，需要冷藏，施沛特除外，制备方法原因吧，不了解！

质量差的或者注射方法不对的，容易引起发热，积水肿胀！ 就知道这些了！

你们谁知道有什么细菌内毒素检查法中常用的缩写词？

有必要。原因如下：1－如果是无菌产品，当然应该检验无菌项目，还应该检验药品标准含有的热原、内毒素等项目。

2－对于非无菌原料药，按照用途可以分为2种情况，

A--如果原料用于生产可以最终灭菌的针剂，那麽原料应该检查微生物限度。如果微生物限度负荷很高，及时最终产品经过灭菌工艺无菌检查合格，细菌尸体仍在产品里面，也不能避免热原或者内毒素项目不合格。

B－－对于那些用于口服药品的原料，按照中国药典附录，制剂应该控制微生物限度，那麽原料当然应该控制微生物限度，否则制剂的微生物限度很难保证。

进行硬件施工，一定考虑周全，并且具有前瞻性，否则很容易被动。

细菌内毒素不同实验条件对结果的影响

TAL：东方鲎鲎试剂（Tachypleus Amebocyte Lysate）

LAL：美洲鲎鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate）

BET：细菌内毒素检查（Bacterial Endotoxin Test）

TRW/LRW：鲎试剂用水（TAL/LAL Reagent Water）

RSE：内毒素参考标准品（Reference Standard Endotoxin）

CSE：内毒素工作标准品（Control Standard Endotoxin）

λ：在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（Eu/ml）；或在光度测定法中所使用的标准曲线上最低浓度的内毒素浓度。

L：内毒素限值（Endotoxin Limit）。

供试品的细菌内毒素限值L=K/M，以EU/ml、EU/mg、EU/U（活性单位）表示。

K：人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量。

以EU/(kg·h)表示，注射剂K=5EU/(kg·h)，放射品注射剂K=2.5 EU/(kg·h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg·h)。

M：人用每公斤体重每小时最大注射剂量。

以ml(kg.h)、mg(kg.h)、U/ (kg·h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。

MVD：供试品的最大有效稀释（Maximum Valid Dilution）。

MVD=CL/λ, L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，C的单位需为mg/ml或U /ml。

如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，计算供试品的最小有效浓度C=λ/L。

MVC：供试品的最小有效浓度（Minimum Valid Concentration），MVC=λM/K

NC：阴性对照（Negative Control）

NPC：产品阴性对照或供试品阴性对照（Negative Product Control）

PC：阳性对照（Positive Control）

PPC：产品阳性对照或供试品阳性对照（Positive Product Control）

细菌内毒素检查是一复杂的酶促反应过程，检查条件的任何变化都会对实验结果产生影响。中国药典附录”细菌内毒素检验法“项下明确规定：

1、反应温度37℃±1℃，时间60min±2min。反应时间与温度一定要严格控制好，否则会得出错误结论。如果反应温度或反应时间不足都会-----出现假阳性；同时反应温度或反应时间超出药典规定会-----出现假阴性。

2、药典规定该试验应在1万级环境内的100级区域下进行。然而对试验室温度要求在检查项下未做明确规定，但从中国药典凡例三十条4项下：除另有规定外应以25℃±2℃为准。

我本人认为试验环境没有必要控制在1万级环境内局部100级区域下进行，因这种环境反而易污染内毒素（原因：以前试验时污染的内毒素溶液挥发后易从风口吹出）。但实验室温度最好控制在20℃以下，这是一个酶促反应，温度对其影响比较大。

3、供试品溶液的pH值、离子浓度、鲎试剂的灵敏度及操作人员的操作水平等因素都会影响到试验结果。

因此，中国药典2015年版开始对“细菌内毒素检查”做了较大修改：

① 做“鲎试剂灵敏度复核”试验。该试验的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定的一次考核；

② “干扰试验”，当一个新的药品制订“质量标准”时或生产企业的原料来源、配方和生产工艺发生变化时都应做“干扰试验”；消除干扰的方法一般采用BET水稀释或加酸碱调节pH的方法消除干扰。其目的是确证供试品在该试验浓度及试验条件下对鲎试剂与细菌内毒素的反应无干扰作用。

③ 平时做“细菌内毒素检查”试验时，分别做：供试品2管；PPC2管；阳性对照2管；阴性对照2管。并且规定当阳性对照管、PPC管都为阳性且阴性对照管都为阴性时实验才可认为有效。否则，实验结果无效。

原因：如果阳性对照管不是阳性，=====出现该问题的原因最大可能性是出在“细菌内毒素标准溶液的制备”第一步，内毒素标准品或工作标准品加BET水复溶是很关键的一步，一定要按药典操作，既加BET水后在振荡器上振荡，15min，否则内毒素混合不均匀会出现这种清况；其次是更换不同批号或不同厂家的鲎试剂或BET水后，一定要做鲎试剂灵敏度复核试验，否则不知该批鲎试剂灵敏度及检查用水是否符合要求。-

--------阴性对照管不是阴性说明BET水有污染。

---------PPC管应显阳性，而未显阳性说明供试品或供试品稀释液在该试验条件下对试验有干扰。

如对细菌内毒素检查法感兴趣，你可以用“百度”搜索下近年来我在《中国药师》、《中国药业》、〈海峡药学〉等专业杂志上发表的有关细菌内毒素检查内容的文章，“得力生注射液细菌内毒素检查法的探讨”、“吡拉西坦细菌内毒素检查方法的建立”、“长春西汀葡萄糖注射液细菌内毒素检查法的研究”、“地塞米松磷酸钠原料药细菌内毒素检查法的建立”、“利巴韦林细菌内毒素检查法的建立”、“维生素C注射液细菌内毒素检查中干扰问题的探讨”等论文，以加深对该问题的理解。