原料药研究的目的意义-原料药研究指导原则

摘要 本文就如何建立TLC法测定有关物质的方法进行论述，系统地阐述了薄层色谱法各条件确定的原理，并列举了质量标准制订中存在的某些问题。

关键词 薄层色谱法（TLC法） 有关物质 方法建立

有关物质是研究药品中除主成分以外的杂质，它可能是原料药合成过程中带入的原料、中间体、试剂、降解物、副产物、聚合体、异构体以及不同晶型、旋光异构的物质，也可能是制剂过程中产生的降解物，或是在贮藏、运输、使用过程中产生的降解物等[1]。这些杂质的存在直接反映药品的有效性和安全性，故要对其进行研究，特别是在药品申报的质量研究资料中需建立其检测方法，并根据生产、稳定性考核等实际情况考虑是否在质量标准中制订该检查项，规定其限度。目前，有关物质的常用测定方法有高效液相色谱法(HPLC法)和薄层色谱法(TLC法)。

TLC的特点是快速、简便，尤其是对无紫外吸收的杂质测定，更具有其应用价值。如能将TLC法与HPLC法有机地结合、或彼此间进行比对研究，便可得到更多、更为准确的有关杂质信息，做到两方法间的相辅相成，相益得彰！本文将着重讨论如何建立薄层色谱法测定有关物质的方法。

1．测定方法类型

常用的方法有杂质对照品法（适用于已知杂质）和自身（稀释）对照法（适用于一般杂质检查，杂质成分少且尚不能取得杂质对照品）。目前国内由于难以获得杂质对照品、故一般均采用自身对照法。

2．展开剂的确定（即专属性试验）

专属性的研究是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，该点是色谱条件建立的关键。通常采用在被分析物的对照品或精制品中加入一定量的杂质或辅料，证明色谱条件可将各杂质与被分析物分离[1]。这里的关键是：将多少量的杂质加入到多少量的主成分中。正确的作法是将1%(w/w)浓度量的各杂质加入到100%浓度的主成分中，配制这样的溶液来

验证系统适用性。之所以如此配制，目的是模仿样品中有可能存在的状态，即有少量（1%左右）杂质存在时是否能与主成分达到完全分离，只有这样才能比较客观、科学地反映样品中实际存在情况的（见图1）；而不应把该溶液配制成：主成分与中间体相同浓度的。因为一者实际检测时样品中不可能存在此种情况；二者该浓度不易确定，目前国内申报资料中一般的作法均是配制成较低的一致浓度，这样各斑点当然易于完全分离了（见图2），但在实际测定时，由于主斑点急剧增大，很易将相邻杂质包含于主成分斑点中。同样，质量标准中的系统适用性试验用溶液的配制方法亦如此。

（1，3，4为杂质，2为主成分）

图1 图2 （杂质浓度均为供试品溶液浓度的1%）

3．检出条件的确定

其基本出发点是：主成分与相关杂质均应在该条件下显色，且在相同浓度下，斑点大小应基本一致。薄层板的类型根据被测物质的性质来选用，测定有紫外吸收的物质通常选用GF254或GF365板；测定无紫外吸收、需喷显色剂的，常选用硅胶G板或H板，选用该类薄层板时，显色方法根据被测物质的结构式选取，但当有多个显色方法时，应分别进行试验，选取灵敏度最高的显色方法。如醋酸氢化可的松有关物质的测定，中国药典2000年版采用碱性四氮唑蓝试液显色，美国药典26版采用硫酸-乙醇(10:90)溶液显色，两者均为激素类药物的显色方法。醋酸氢化可的松属于激素类中的肾上腺皮质激素，四氮唑法是肾上腺皮质激素的重要显色方法；而硫酸-乙醇显色法则主要是针对激素类中的雌激素的显色反应，对于属于肾上腺皮质激素类的醋酸氢化可的松则反应活性不强，结果两法的灵敏度相差10倍以上。因此，检出条件的确定，一定要在查阅文献的基础上，并根据试验结果进行综合考虑。

4．供试品溶液浓度的确定（灵敏度试验——最低检出限的测定）

供试品溶液浓度的设定在有关物质检测中是至关重要的，浓度越高、越能反映样品中杂质存在的情况，但若设定得过高，则会产生主斑点严重拖尾、“断腰”等超载现象的发生，产生错误结论；若设定太低，又将达不到检测杂质的目的，观测不到杂质量的变化。其设定是根据最低点样量和最大点样量来综合考虑的。

最低检出限虽然是个绝对值，但真正的意义却是其相对值，即相对于供试品溶液的浓度多少而言，所以测定结果不仅要罗列出其绝对值又应列出其相对值，这样最低检出限才有意义！最大点样量则是通过不断加大供试品溶液浓度，直至主斑点严重拖尾、“断腰”等情况出现时来得到的。然后根据最低检出限，采用“上推法”来确定：如一般设定杂质斑点小于1.0%对照斑点，对照溶液的浓度至少应为最低检出浓度（即最低检出限）的20~50倍，则供试品溶液浓度是最低检出浓度的2000~5000倍；反过来，最低检出浓度应至少达到供试品溶液浓度的0.02%~0.05%。应注意的是：由于最低检出量和最大点样量因试验环境、薄层板质量以及即时试验时其他各因素的不同而改变（即耐受性因数），故供试品溶液的浓度在保证小于最大进样量的情况下，可在此基础上设定得再高一些，以保证该浓度可适用于各种条件下。举例说明见表1（规定杂质限度为1.0%）。

表1 最低检出量、最大点样量、供试品溶液和对照溶液浓度之间的比例关系

最大点样量

供试品溶液

对照溶液

最低检出量 浓 度 8mg/ml 3mg/ml 30μg/ml 1μg/ml 点样量 10μl 10μl 10μl 10μl 绝对量 30μg 0.3μg 10ng 相对于样品测定浓度的 100% 1.0% 0.02% 倍 数 关 系 5000倍 30倍 “基准点”

供试品溶液浓度也可设定得再高些，但不可超过最大点样量。

5．加样回收试验（即准确性试验）

准确性试验可采用在预经有关物质测定后的样品中，加入已知量杂质的方法来评价。准确称取各杂质，将含有1%(w/w)浓度的各杂质加入到样品溶液中，以验证所采用的薄层测定条件是否可分离检测出相应的各杂质以及样品中已存在的杂质是否累加，斑点是否加深。该原理同前面所述的专属性研究是一致的。

6．强力破坏试验

该项研究是为了揭示原料药内在稳定性的特性，它是开发研究的一部分。这些试验是在比加速试验更剧烈的条件下进行的，其能够包含药品在销售过程中所遇到的剧烈条件。可取一批样品通过强光、高温、高湿、氧化破坏、以及酸碱破坏来证明该展开条件能分离检测出杂质。

7．展开距离

测定时一定要采用25cm、长薄层板，展开距离应尽可能长一些，以使杂质与主成分尽量分离。如用短板，易造成临近主斑点的杂质斑点“躲进”主斑点中。但同时又应注意，距离拉大，斑点分散，会损失最低检出限，降低灵敏度，故应综合考虑。

8．其它的因素

展开温度应尽量控制在20~25℃之间，尤其在冬季，应注意环境的温度，如太低，将严重影响展开效果。另层析缸的盖儿，应涂抹凡士林油，以保证整个试验过程中，层析缸的密封，避免展开剂挥发；并应在展开前，预先倾入展开剂，以使层析缸内的空气饱和，达到最佳的展开效果。薄层板由于有自制、市售，质量不一也应注意。

二．讨论

1． 质量标准中的系统适用性试验，最好能将最难分离的杂质订入系统适用性试验用溶液的配制，将此杂质的浓度配制为主成分浓度的1%，或0.5%，或0.2%（依据杂质限度而定）进行试验，验证分离度后，再进行样品的测定，以确保试验的准确进行。

2． 质量标准中，应配制系列浓度的对照溶液（即梯度对照），以对杂质有“半定量”的概念，这可更好地评价杂质存在的情况；并应规定杂质的个数及最大杂质斑点的限度，使质量标准更完善、科学。经查阅，中国药典薄层色谱法测定有关物质的有70个品种，仅有2个品种采用了梯度对照，绝大部分品种仅是制定了对照溶液，均未规定杂质个数，和最大杂质斑点限度，如有若干个杂质斑点也无法判定；而英国药典和美国药典则几乎每个品种均采用梯度对照，并规定杂质个数和最大杂质斑点限度，这一点值得学习和推广。

3． 错误的一种误区，认为HPLC法完全替代了TLC法，这是不正确的，一定要做到相互补充、相互论证、相互参考才是最客观、最科学的！

本文是在参阅了日本《分析方法验证》一书和大量日本国内新药申报资料中质量研究部

分的内容所写而成。

原料药结构确证所用样品可以是小试样品吗

1）二者的不同点 是 研究 目的不同， 手段 也可 稍有 区别。 如 某 原料药 在 60C，10 天， 都很稳定。对影响因素实验 来说 结论是 可以 在 60C 稳定 10天。 但 对强制降解实验， 需要 更高温度 或 更长时间，让其 有 一定的降解。

2）影响因素实验， 又叫条件试验， 目的是考察 物质 在一些 极限条件下的 稳定性。是稳定性考察的内容之一。

3） 强制降解实验，又叫 破坏性实验。是将 要研究的 物质 在 某些 极限条件 下 产生降解物。目的是 一方面 用于 分析方法 的建立 和 评价， 另一方面 推断 降解途径。

国内的药企想出口原料药/制剂，怎么寻找目的市场合作客户？

1、中试——小型生产模拟试验 ?是从小试过渡到工业生产必不可少的重要环节； ?是在模型化的生产设备上（设备的设计要求和操作原 理与生产设备相同）基本完成由小试工艺向生产操作 规程(草案)的过渡； ?确保按操作规程（草案）能始终如一地生产出预定质 量标准的产品/中间体。

2、进行中试的条件 ?产品的合成路线已确定； ?小试的工艺考察已完成： ?各部反应的工艺过程及工艺参数已确定（如加料方式、 反应时间、反应温度、压力、终点控制，提取、分离、 结晶、过滤、干燥等）； ?对成品的精制、结晶、分离、干燥的方法及要求已确 定（晶型、残溶）； ?小试的3~5批稳定性试验说明该小试工艺可行、稳定； ?必要的材质腐蚀性试验已经完成； ?已建立原料、中间体和产品的质量控制方法/质量标准。 成熟的小试是进行中试/生产的最主要的基础

3、中试要实现的目标

目的

1、考查小试工艺的工业化生产的可能性，核对、校正和 补充实验室数据，并优化工艺条件；

2、制定生产工艺规程；为车间设计、施工安装、中间质 控以及生产管理提供必要的数据和资料。 〇物料和能量衡算，计算产品质量、经济效益、劳动强 度等

3、解决实验室阶段未能解决或尚未发现的问题；

4、为临床前的药学和药理毒理学研究以及临床试验提供 一定数量的药品。

指导原则（第二稿）对化学原料药的中试放大提出了八 项主要任务

1、考核实验室提供的工艺路线在工艺设备、条件、原材料等 方面在中试放大时是否有特殊的要求，是否适合工业化生 产；

2、确定所用起始原料、试剂或有机溶媒的规格或标准

3、验证小试工艺是否成熟合理，主要经济指标是否接近生产 要求；

4、进一步考核和完善工艺条件，对每一步反应和单元操作均 应取得基本稳定的数据；

5、根据中试研究资料制订或修订中间体和成品的质量标准、 分析方法；

6、根据原材料、动力消耗和工时等进行初步的技术经济指标 核算；

7、提出“三废”的处理方案；

8、提出整个合成路线的工艺流程，各个单元操作的工艺规程。 一般来说，中试所采用的原料、试剂的规格应与工业化生 产时一致。

药物制剂处方前研究包括

参加国外的医药医疗和制剂科技博览会，与国外的制药公司洽谈，寻求合作，嵌入对方的工艺流程，提供其中的某一个制剂，取得对方的技术和专业审核认可，成为对方某一产品的一个不可分割的工银链中的一环，你就成功了。

影响药物制剂稳定性的外界因素

药物制剂处方前研究包括：

1、获取药物的相关理化参数，包括物理性状、熔点、沸点、溶解度、溶出速度、多晶型、pKa、分配系数、化学性质等。

2、测定其药物动力学特征如半衰期，消除速度常数，吸收情况、代谢情况、血药浓度等。

3、测定与处方有关的物理化学性质如粉体学性质、液体流变学性质、表面性质等。

4、测定药物与辅料间的相互作用，辅料对药物溶解性、稳定性的影响等。

拓展：

处方前研究的目的是提供处方工艺设计的依据，并对处方工艺研究中出现的问题提供机理明确的针对性的解决方案。制剂终产品的质量特性在很大程度上是由原料药的性质决定的：尽管也有很多手段来改善制剂的质量特性和工艺可靠性, 但这些手段的有效性往往不如对原料药的特性进行控制。现代产品开发的趋势是把控制点前移。在QbD研发要求里，处方前研究的另一重要目的是为制剂研究提供初步风险评估的依据，确定制剂研究的方向和范围。

新药的开发研制过程是怎样进行的?

影响药物稳定性的外界因素有温度、光线、金属离子、空气/氧、湿度和水分、包装材料等。

1、温度。

温度的升高会加快药物的降解反应，从而影响药物的稳定性。

2、光线。

光线通常具有一定的辐射作用，可能会导致药物发生氧化反应，如酚类药物。

3、金属离子。

微量金属离子会加快药物的自氧化反应，如铜、铁、铂、锰等，会导致药物的稳定性发生变化。

4、空气/氧。

空气中含有氧气，药物如果直接与空气接触，会容易发生氧化作用而变质，影响药效。

5、湿度和水分。

如果将药物放在湿度较大的环境中，会导致药物受潮变软，影响药物作用。

6、包装材料。

药物的包装材料如果比较劣质，可能会使药物发生损坏失效，对药物的稳定性产生影响。

患者要把药物放在密闭且避光的环境内，发现药物发生变质等不良表现时，应及时咨询医生，必要时可重新购药服用。

研究药物制剂稳定性的意义：

1、概念。

药物制剂的稳定性是指药物在体外的稳定性，它贯穿于药物制剂的研制、生产、储存、运输和使用全过程。药物制剂应符合安全、有效、稳定的基本要求。

2、目的。

稳定性研究的目的是考察原料药或制剂的质量在温度、湿度、光线等条件的影响下随时间变化的规律，为药品的生产、包装、储存、运输条件和有效期的确定提供科学依据。

药物制剂如不稳定，则会产生物理和化学等方面的变化，如吸湿结块、分解变质等，有的除外观变化外，还会导致药效下降，产生毒副作用，甚至可能危及生命，给个人和企业带来极大的精神和经济损失。

3、意义。

我国的《新药审批办法》明确规定，在新药研究和申报过程中必须呈报稳定性资料。所以重视和研究药物制剂的稳定性，以指导合理地进行剂型设计，提高制剂质量，保证药效和安全，促进经济发展就显得尤为重要。

新药研究开发的过程

研发过程需要经过药物的设计与筛选、化学合成与改造、药剂学与药动学研究、工艺与制剂、质量检测与控制、安全性与临床评价、市场反馈等等许多步骤，面临问题复杂。

按照工作内容的不同可将新药研发分为四个阶段：发现和甄别、临床前研究、临床研究、新药申报及后续工作。

第一、发现和甄别包括基础研究和应用研究（包括药品制备和初筛），发现和筛选药物来源。

第二、临床前研究包括为了确定药物安全性和有效性所作的实验和动物试验及其准备工作，既药学、药效、药理和毒理并进行临床申报。

第三、临床研究包括I（初步临床药理学研究、人体安全性研究），II（治疗作用初步评价、安全性研究，III期临床试验及其准备工作（扩大临床试验、特殊临床试验、补充临床试验、不良反应观察）。

第四、新药申报及后续工作包括新药申报，以及由于SFDA（国家食品药品监督管理局）对新药申报进行复查所要求做的额外工作。

新药研究开发的过程是十分漫长而复杂的。简单地说一下，申报材料大致是四个部分：

1.综述资料

2.药学研究资料

3.药理毒性研究资料

4.临床研究资料

后三个部分都要经过严格的实验，反复观察，通过数据得出可靠的结论，才能作为真实的资料用于申报新药。尤其是临床研究部分。

但是，说实话，在中国，大多数新药都是改变一下给药途径，改变一下药物的某个基团、剂型等等，没有本质上的新药在研究开发出来。

中国一年内注册的新药是美国的几百倍，为什么？因为药监局是很喜欢有新药注册的，这个不详细说了。