吖啶酯发光免疫的缺点-吖啶酯的发光底物是什么

2024-11-07 21:17:18

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，许多大中型城市，乳腺癌已居女性恶性肿瘤亡率的首位。乳腺癌复发转移是导致乳腺癌患者亡的最主要原因，淋巴结阴性的患者中约有24%～30%出现复发转移，淋巴结阳性的患者中复发转移率高达50%～60%，而转移性乳腺癌的5年生存率仅为26%。

萤火虫荧光素酶（Luciferase）是一种常用的信号分子，可以用来标记肿瘤细胞.

一．细胞方法

将带有荧光素luc转酶报告基因的真核表达重组质粒pRc/CMV2-7，利用G418筛选，获得稳染人乳腺癌细胞株MCF-7-luc，并在稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆MCF-7体外评价其发光能力。通过建立裸鼠移植瘤模型，利用活体生物发光成像系统检测肿瘤生长及转移情况，为下一步监测裸鼠移植瘤对药物作用的变化情从而为分析药物对肿瘤的治疗效果提供理想的状况.

G418筛选浓度的确定：

37℃细胞培养箱中常培养,G418按0、200、400、600、800、1000μg/ml设置6个浓度梯度。在细胞接种24h后，加入6孔板中，每个浓度设2个孔在10～14d内全部亡。每天观察细胞生长情况，亡最低的G418浓度，即为筛选质粒转染克隆MCF－7细胞的浓度。

1)细胞转染

取对数生长期的MCF－7细胞，将细胞接种于6孔板内待细胞融合度达到80%～90%孔培养板中，TM即可转染。按照Lipofectamine2000试剂盒操作指南进行转染。在250μl无血清、无双抗的DMEM培培养基中加入luc质粒8μg/ml的pRc/CMV2-在250μl无血清、无双抗的DMEM培养基中加入10μlLipofectamineTM2000，室温培育5min。将上述2种稀释液混匀，室温培育30min后加入细胞孔板中，置于培养箱常规培养。

转染24h后胰酶消化细胞并按1∶6比例接种到新6孔板中，同时加入实验确定的浓度G418，随后每2d更换一次培养基并维持G418筛选直至单细胞抗性克隆的出现。分别挑选单一抗性克隆至96孔板，待其逐渐增殖后转入24孔板中继续传代培养。

3)荧光素酶活性鉴定阳性克隆

单一抗性克隆传代至第五代时用LuciferaseAs-sayAystem检测荧光素酶活性。检测时，各克隆按1×105个/孔接种到24孔板，24h后细胞裂解液裂解12000rpm，4℃离心10min，收集裂解物，取上清10μl加入96孔白板中，向每孔加入50μl荧光素酶96microplateluminometer连续读底物，停留2s后，取10s的荧光值（RLU），每个克隆设3个复孔，保留RLU值高的细胞克隆继续传代培养，再过5代后进行荧光素酶活性检测。保留RLU值维持较高的克隆直至第30代，荧光素酶活性最高的几个克隆MCF-7-luc即为阳性克隆.

各不同数量细胞克隆的荧光值检测7-luc阳性克隆细胞按细胞数将筛出的MCF-4×104、2×104、1×104、5000、2500、1250、625、312和156分别接种到96孔黑板中，另外一组仅有细胞，一组仅有培养基作对照，设置2个复孔，常规培去上清并用PBS洗两次，每孔加入100μl养24h后，Luciferin使其终浓度为150μg/ml，PBS，再加入D-立即用活体成像系统检测，分析发光强度与细胞数之间的相关性。

4)细胞生长曲线绘制

MCF7-luc细胞和作为对照取表达荧光素酶的MCF-7细胞，接种于24孔板，接种密度为2×104/孔。细胞接种后1～7d，每天胰蛋白酶消化其中3孔细胞，用细胞计数仪测定细胞数。以细胞生长天数为横坐标，细胞数目为纵坐标，分别绘制两种细胞生长曲线。

二．动物模型

BLAB/c裸鼠皮下移植瘤模型的建立BLAB/cnu/nu裸鼠，4～5周龄，体重（15±2）g，雌雄各3只。取对数生长期的MCF-7用PBS重悬为2．5×10/ml悬液，每只裸鼠左右背侧近腋部皮下接种100μl，共接种6只。接种后第5d采用德国BERTHOLD公司的活体成像系统检测信号强度。以后每5d观测一连续观测30d。观测前每只裸鼠戊巴比妥钠麻醉（计量为：35mg/kg体重），按150mg/kg体重的量腹腔注射luciferin（invivograde），10min后，进行活体成像观察皮下肿瘤的生长情况，定量分析各时间点的荧光值。绘制肿瘤皮下生长曲线.

MCF-7-luc细胞裸鼠皮下移植瘤的病理形态学观察

MCF-7-luc细胞裸鼠皮下接种后25d，脱颈处小鼠，取肿瘤组织，制成石蜡切片，切片厚度为3μm，经HE染色后观察细胞的病理形态学。

活体动物成像技术是近期发展起来的一种新型稳定可靠,是检测动物体内分子及细胞事件的影像检测技术，强有力手段。利用生物发光成像（BLI）可以对活体病灶的大小进行无损伤直观准确检测。

我们有自己的独立有机合成实验室，可以生产合成各种化学发光试剂，我们可以提供化学发光试剂、化学发光底物、发光标记物、发光增强剂、染料探针类、微生物和酶的显色底物以及体外诊断试剂。

化学发光剂的常用发光剂

答案：B

A项，吖啶酯类是目前常用的直接标记发光剂。BD两项，目前化学发光酶免疫测定中常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）。辣根过氧化物酶催化的发光剂为鲁米诺及其衍生物；碱性磷酸酶催化的发光底物为AMPPD。C项，三联吡啶钌是电化学发光剂。E项，4-MUP（4-甲基伞酮磷酸盐）是碱性磷酸酶反应的荧光底物。化学发光酶免疫测定中常用来标记抗原或抗体的物质是鲁米诺。

化学发光免疫分析原理是什么

酶促反应的发光底物

酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物，目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。HRP的发光底物为鲁米诺或其衍生物和对-羟基苯乙酸。AP的发光底物为3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物）。

（1）.鲁米诺或其衍生物。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.1mol/L pH8.6Tris缓冲液作底物液。要注意是:首先,鲁米诺和H2O2在无HRP催化时也能缓慢自发发光，而在最后光强度测定中造成空白干扰，因而宜分别配制成2瓶试剂溶液，只在用前即刻混合;其次, HRP发光增强剂如某些酚试剂（如邻－碘酚）或萤火虫荧光素酶可增强HRP催化鲁米诺氧化的反应和延长发光时间，提高发光敏感度。

（2）.对-羟基苯乙酸（HPA)。对-羟基苯乙酸（HPA）在H2O2存在下被HRP氧化或氧化二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光，可用荧光光度计测量。

（3）.AMPPD。 AMPPD在碱性条件下，被ALP酶解生成相当稳定的AMP-D阴离子，其有2-30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度达到高峰，15-60min内光强度保持相对稳定。

（4）4-MUP。 4-MUP被ALP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的激发光的作用下，发出448nm的荧光，用荧光光度计进行测量。

直接化学发光剂

直接化学发光剂不需酶的催化作用，只需改变溶液的pH等条件就能发光的物质，如吖啶酯（acridinium, AE）在有过氧化氢的稀碱溶液中即能发光。

电化学发光剂

电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+（图16-7）和电子供体三丙胺（TPA）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，成为强氧化剂，TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+，它很不稳定，可自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA.，成为一种很强的还原剂，可将一个高能量的电子递给三价的[Ru(bpy)3]3+使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+.。激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出一个波长为620nm的光子，回复到基态的三联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强。

化学发光免疫分析技术的类型

化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子(hM)，利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上，或酶作用于发光底物。

化学发光免疫分析根据其所采用的标记物的不同可分为发光物标记、酶标记和元素标记化学发光免疫分析三大类。发光物标记的CLIA是以发光物质代替放射性核素或酶作为标记物(如吖啶酯)，在反应体系中发光物质在碱性介质中氧化时释放大量自由能，产生激发态的中问体，该激发态的中间体由最低振动能级回到稳定的基态，各个振动能级产生辐射时，同时产生能量，多余的能量即为发射光子，从而产生发光现象。利用发光信号的测量仪器，分析接收的光量子产额，通过计算机系统转换成被测物质的浓度单位。在此系统中包含两个部分，化学发光反应系统和免疫反应系统，即在抗原一抗体特异性反应过程中，伴随有化学反应过程而产生光的发射现象。化学反应系统中以化学反应为基础，化学发光的首要条件是吸收了化学能而处于激发态的分子或原子必须能释放出光子或者能将能量转移到另一个物质的分子上并使这种分子激发，当这种分子回到基态时释放出光子。

化学发光与荧光的根本区别是形成激发态分子的激发能原理不同。荧光是发光物质吸收了激发光后使分子产生发射光；化学发光是化学反应过程中所产生的化学能使分子激发产生的发射光。因此，化学发光反应过程必须产生足够的激发能是产生发光效应的重要条件。化学发光反应可在气相、液相或固相反应体系中发生，以液相发光在免疫学检测中最常应用。摘自引自化学发光免疫分析仪的发光试剂

化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种:

(1)化学发光标记免疫分析法;

(2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析( chem ilum inescen t enzym e imm unoassay,

CL E IA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同[ 5 ]: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。常用的底物为鲁米诺(32氨基邻苯二甲酰肼,lum ino l) , 或其衍生物如异鲁米诺(42氨基邻苯二甲酰肼) , 是一类重要的发光试剂。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行, 在过氧化物酶及活性氧[ 过氧化阴离子(O 2- ) , 单线态氧(1O 2 ) , 羟自由基(OH·) , 过氧化氢(H2O 2) ]存在下,生成激发态中间体, 当其回到基态时发光, 其波长为425nm。

早期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体) , 但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体, 进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物, 在过氧化物酶和起动发光试剂(N aOH2H2O 2) 作用下, 鲁米诺发光, 发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。Kodak Am erliteTM 半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的。 (enhanced lum ines2cence enzym e imm unoassay, ELEIA )

在发光系统中加入增强发光剂, 如对2碘苯酚等, 以增强发光信号, 并在较长时间内保持稳定, 便于重复测量, 从而提高分析灵敏度和准确性。在全自动分析仪上, 还可通过计算机严密控制, 进行自动操作, 如加试剂, 混合, 温育, 洗涤, 加发光试剂, 发光计数, 数据处理, 绘制标准曲线, 直至完成病人血清样品的分析并打印出结果。Am erliteTM 发光增强酶免分析系统用荧光素、噻唑等增强剂, 其发光时间可持续长达20m in, 试剂盒有甲状腺功能检测的

促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素, 与性激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮, 以及其他方面的如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。所用底物为环1, 22二氧乙烷衍生物, 这是一类很有前途的发光底物 , 用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团——金刚烷基, 其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团, 在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。最常使用的底物是AM PPD [ 32(2’2 sp iroadam an2tane ) 42m ethoxy242( 3’2 pho spho ryloxy) 2phenyl21,22dioxetane ], 中文名为: 32(2’2 螺金刚烷) 242甲氧基242(3’2 磷酰氧基) 2苯基21, 22环二氧乙烷)。在碱性磷酸酶(AL P) 作用下, 磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基, 得到一个中等稳定的中间体AM PD (半寿期为2～ 30m in) , 此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子, 当其回到基态时产生470nm 的光, 可持续几十分钟(如图5)。AM PPD 为磷酸酯酶的直接化学发光底物, 可用来检测碱性磷酸酯酶或酶和抗体、核酸探针及其它配基的结合物。可检测到碱性磷酸酯酶的浓度为10- 15mo l?L 。

美国DPC 公司的Imm u lite 全自动酶放大发光免疫分析仪, 以碱性磷酸酶为标记物, 以金刚烷作发光底物, 测定灵敏度相当于10- 21mo l?mL 的酶, 采用聚苯乙烯珠作载体, 其检测水平已能达到10- 12g?mL。

HRP 标记的CLEIA常用的底物为鲁米诺(32氨基邻苯二甲酰肼,lum ino l) ,或其衍生物如异鲁米诺(42氨基邻苯二甲酰肼) , 是一类重要的发光试剂。其结构如图4 所示。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行,在过氧化物酶及活性氧[ 过氧化阴离子(O 2- ) , 单线态氧(1O 2 ) , 羟自由基(OH·) , 过氧化氢(H2O 2)]存在下,生成激发态中间体, 当其回到基态时发光, 其波长为425nm。

早期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体) ,但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体, 进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物, 在过氧化物酶和起动发光试剂(NaOH2H2O 2) 作用下, 鲁米诺发光, 发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。Kodak Am erliteTM半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的。