吖啶橙染液-吖啶橙用什么稀释

吖啶橙：3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl?, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔**或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙AO常与溴化乙啶EB合用双染，因EB只染细胞使之产生桔**荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏细胞.它还可以用作移码突变的诱变剂,能镶嵌于两个相邻的碱基对之间，这样在DNA复制过程中，会使DNA链增加或缺失一个碱基，造成移码突变。吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。

细菌染色方法有哪些

一、常用的染色方法有革兰氏染色(最基本)、芽孢染色、荚膜染色、鞭毛染色等。

二、.1 革兰染色法 （1）取含金**葡萄球菌和大肠埃希菌的混合菌液涂片、干燥、固定;（2）染色:用结晶紫染液染1min，水冲洗;卢戈碘液染1min，水冲洗;0.4%复红酒精溶液染30s，水冲洗;（3）吸干后镜检［2］ 。

1.2 抗酸染色法 （1）取结核杆菌阳性的痰标本（已处理）涂片、干燥、固定。（2）染色:将石炭酸复红染液沸水浴10min，滴加2～3滴覆盖菌膜染色 5min，水冲洗，3%盐酸酒精脱色30s，水冲洗;碱性美兰复染30s，水冲洗。（3）吸干后镜检［3］ 。

1.3 荚膜染色法 （1）取接种肺炎球菌亡的小鼠腹腔液涂片、干燥、固定;（2）染色:用石炭酸复红染液染1min，水冲洗;95%酒精脱色5s水冲洗;20%鞣酸溶液媒染10min水冲洗;0.8%孔雀绿溶液染色1min，水冲洗;（3）吸干后镜检［4］ 。

1.4 芽胞染色法 （1）取等量破伤风杆菌厌氧培养菌液和5%孔雀绿水溶液，放入小试管中充分混合，沸水浴20min;取上述混合液涂片、干燥、固定;（2）用 1%沙黄液复染10min，水冲洗;（3）干后镜检。

2.1 革兰染色 镜下，金**葡萄球菌染成紫色、球形，为革兰阳性菌;大肠埃希菌染成红色、杆状，为革兰阴性菌。革兰染色法是细菌学中最经典，应用最广泛的染色法之一。脱色是影响革兰染色的关键步骤，脱色时间长短直接关系到染色结果的准确性［5］ 。脱色过度则革兰阳性菌可能被误染为革兰阴性菌，脱色不 够则革兰阴性菌可能被误染为革兰阳性菌，为此学生难以把握。现将原有四步染色法改为三步法，即把第三步酒精脱色和第四步复红复染合并一步进行，使用 0.4%复红酒精溶液作为复染剂，可达到脱色和复染双重目的。这样，就可以避免学生在四步法中因脱色时间不易掌握而造成染色的失败，减少重复性实验，提高了教学效果。

2.2 抗酸染色 镜下，结核分枝杆菌染成红色，为抗酸菌;背景和其他菌被染成蓝色，为非抗酸菌。传统的方法是滴加石炭酸复红染液于涂片上，用玻片夹夹住涂片以微火烟叶热，保持染液冒蒸汽约5min，此法学生容易使染液蒸干或使染液沸腾，从而影响染色效果和污染环境。改良后的方法是将染液直接加热改为水浴后使用，克服上述的缺点，且染色效果良好。适合实验教学使用。

2.3 荚膜染色 镜下，肺炎球菌菌体染成红色（成双排列），荚膜染成绿色，存在于菌体的周围。传统的荚膜染色是用结晶紫染液染色，菌体染成紫色，荚膜染成淡紫色或无色，菌体和荚膜之间反差小，不易分辨。改良后，增加了脱色、媒染、复染的步骤，使菌体和荚膜之间反差增大，易于观察，可用于学生实验和示教片的制作。

2.4 芽胞染色 镜下，破伤风杆菌的菌体染成红色，芽胞染成绿色。传统的方法是滴加石炭酸复红染液于涂片上并弱火加热，使染液冒蒸汽约5min，此法染液用量大，且容易污染衣物和实验台。现改为菌液和染液混合水浴加热初染，然后制备涂片、固定、复染，即节约时间，染液消耗又少，且菌体、芽胞对比鲜明。此法适用于教学标本片的制作。

三、简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

操作步骤

1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。

2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。

3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。

4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。

5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。

6．干燥

7．镜检

关于细胞生物学实验的问题！！！！

1 革兰氏染色法 是最常用的鉴别染色法之一。此法起始1881年，染色步骤是先用结晶紫或龙胆紫染液加于已固定好的标本上使之着色，其后加碘液作媒染剂，再用酒精脱色，最后用复红或沙黄复染。革兰氏染色的结果与培养基成分、培养条件及操作技术等有密切关系。如涂片太厚影响酒精脱色，革兰氏阴性菌则可染成革兰氏阳性菌。脱色时若酒精作用时间太长, www.ttplay8.cn ,革兰氏阳性菌又会染成革兰氏阴性菌。在缺乏镁盐的培养基中，革兰氏阳性菌可变成革兰氏阴性菌。菌龄也能影响染色的结果，这与生长过程中核酸含量的改变有关。革兰氏染色法的原理还不十分清楚，有化学学说、等电点学说、渗透性学法，目前最通常的解释是革兰氏阳性菌在95%酒精中因含粘肽多而导致细胞壁脱水，通透性减低，使在细菌细胞内着色的染料─碘复合物不易透出细胞壁，所以保留了紫色；革兰氏阴性菌含粘肽少，其细胞壁在95%酒精作用下通透性变化不大，酒精容易进入菌体内溶解染料─碘复合物而透出，失去紫色后被复染成为红色。 2 抗酸染色法 有些细菌，如结核杆菌，不般不易着色，一旦染上色后又不易被盐酸酒精脱色，称为抗酸菌。主要步骤是将细菌涂片、干燥、固定后，以石炭酸复红染液加温进行染色，然后用含酸的酒精脱色，最后用美蓝复染。一般细菌以及标本中的物质都被脱色，抗酸菌则不能，仍为红色。在蓝色背景上呈红色的细菌即为抗酸菌。 3 细菌特殊结构的染色法 细菌的特殊结构，如鞭毛、荚膜、细胞壁、芽孢及异染颗粒等，用普通染色法不易着色，故需用特殊染色法。 4 负染色法 是指背景着色而细菌本身不着色。常用墨汁负染色法配合单染色法（如美蓝）检查细菌的荚膜，背景呈黑色，菌体染成蓝色, www.qq1880.com ,荚膜不着色，包绕在菌体周围，成为一层透明的空圈。 5 荧光染色法 用荧光染料，如金胺、吖啶橙等进行染色。细菌用荧光染料着色后在荧光显微镜下检查，可在黑的背景中观察到细菌发出明亮的荧光。用荧光染色法检查细菌，有加快检查速度和提高阳性率等优点。

求采纳

吖啶橙染色后观察红细胞是什么颜色的！

实验、叶绿体的分离与荧光观察

实 验 目 的

1. 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。

2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。

实 验 原 理

将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间, 有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。

实 验 用 品

一、器材

1.主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。

2.小型器材: 500ml烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。

二、材料 新鲜菠菜。

三、试剂 0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。

实 验 方 法

一、叶绿体的分离与观察

1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。

2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3~5min。

3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。

4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。

5. 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即不叶绿体(混有部分细胞核)。

6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮、

7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。

(1)在普通光镜下观察。

(2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。

(3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。

二、菠菜叶手切片观察

用剔须刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。

(1)在普通光镜下观察。

(2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。

(3) 观察间接荧光：向手切片上滴加1～2滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液, 加盖片后可在荧光显微镜下观察间接荧光。

实 验 结 果

一、叶绿体的分离和观察

1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。

2. 以Olympus荧光显微镜为例，在先用B(bule)激发滤片、B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。

3. 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。

二、菠菜叶手切片观察

1. 在普通光镜下可以看到三种细胞 (1)表皮细胞: 为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞; (2)保卫细胞: 为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3)叶肉细胞: 为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。

2. 在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱, 气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。

3. 用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光, 气孔仍为绿色。

作 业

1. 在普通光学显微镜下，用目微尺和台微尺测量一下叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。

2. 在荧光显微镜下，观察叶绿体的自发荧光时，更换滤镜系统，叶绿体的颜色是否有变化？

实验五、 植物染色体标本制备与观察

实验目的

学习植物染色体标本的制备技术，了解Feulgen反应的基本原理,学习其操作方法和压片法,初步掌握细胞分裂各期的主要特点.

核酸是生物最重要的组成成分,核酸分为两大类,即脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA).它们在细胞内的分布及化学性质均有所不同.DNA主要分布在核的染色质或有丝分裂过程中出现的染色体内.RNA分布在细胞质和核仁内.但在染色质及染色体中也含有少量的RNA,核仁中也有少量的DNA.在线粒体,叶绿体等细胞器内除含有RNA外,也含有少量的DNA.

实验原理

Feulgen反应的原理是根据DNA经弱酸(1mol/L)水解后,打开料嘌呤和脱氧核糖连接的键,在脱氧核糖的一端形成有离的醛基.这些醛基就在原位与Schiff试剂结合,形成含醌基( )的化合物,醛基是一个发色团所以具有颜色,因此凡有DNA的部位,就呈现紫红色.

实验材料

大麦、黑麦或小麦种子

实验内容

植物染色体标本的制备及DNA的显示法-Feulgen反应

压片法

细胞有丝分裂相的观察

实验步骤

（一）植物染色体标本的制备

1、将植物种子放在潮湿的滤纸上，20°C发芽，待胚根长至1～2cm时，切取0.5cm长的根尖部分。

2、预处理：将切下的根尖浸入0.1%秋水酰素液中，室温下处理3～4小时。

3、固定、水解及染色：

Camoy固定剂

固定10-30分钟 ? 95%酒精10分钟 ? 70%酒精10分钟 ? 蒸馏水 →(对照) 5%三氯醋酸 ? 90oC 15分钟

1mol/L HCl ← 蒸馏水 ? 1mol/L HCl ? 60 oC 8分钟 ? Schiff试剂40 -60分钟 ? 亚硫酸水(1,2,3) ? 换3次,每次5分钟自来水 ? 将染色后的根尖漂洗干净,悬着染色效果好的材料 ? 蒸馏水 ? 压片 ? 镜检

(二) 压片法

压片的操作步骤如下,把根尖放在载片上,用刀片切取根尖(0.3cm),纵切根尖,加一滴水,用解剖针将根尖纵向分成若干小条,保留1-2小条,加盖玻片,用铅笔端轻轻敲击盖玻片,使细胞分离,压平呈云雾状.

（三）蚕豆(或洋葱)根尖压片的观察

首先在低倍镜下,区分根尖的分生组织区及延长组织区的细胞,然后,在高倍镜下,观察细胞核的形态,注意在你的片子上,是否有有丝分裂细胞,如有,你能找到细胞分裂期的几个阶段,其特征如何 (可参照附录)

做Feulgen反应时,应注意的几个问题

固定剂的选择:一般常选用Carnoy固定液.其他的固定剂如Flemming固定剂及Champy固定剂等均可用,但不能使用Bouin固定剂.

水解时间:水解时间一定要合适,不宜过长或不足,否则会影响实验结果.如用Carnoy固定液固定的材料,水解时间一般在8-15分钟之间.水解时间的长短要随不同的材料及不同的固定剂而定.

Schiff试剂的质量:在做Feulgen反应时,重要的因素就是Schiff试剂的质量问题.实验时,要注意试剂颜色是否正常,有无SO2的气味.

洗涤剂的重要性:漂洗时,所用的亚硫酸水,最好在每次实验前临时配制,以便保持较浓的SO2.

实验对照组:一定要做对照片,以便说明实验结果的真实性.

操作过程中,用镊子镊取根尖的生长区部位,切勿夹取根冠部位.

鸦片过程中尽量使根尖分生组织细胞保持原来的分布状态.

习题

简述Feulgen反应的原理

欲得到一张好的Feulgen反应制片,制片过程中应注意些什么

绘制细胞分裂图。

实验六 植物原生质体的制备

实验目的

1.学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体的形态。

2.学习植物原生质体的融合技术，观察不同方法融合细胞的形态及变化。

实验用品

显微镜，擦镜纸，剪子，镊子，小平皿，吸管四支，直式漏斗，300目尼龙网，10ml离心管，载片，盖片。

实验原理

原生质体（protoplast）这个术语最早是由Hanstein在1880年提出来的。确切地说，食用菌原生质体是指细胞壁完全消除后余下的那部分包裹的裸露的细胞结构。

植物的花瓣细胞在经过纤维素酶，离折酶处理后，纤维素和果胶成分遭到破坏，造成原生质体脱离细胞壁进入培养液中。

植物花瓣细胞中的大液泡中存在有大量色素，且不同的细胞色素不同，因此可以在不对细胞染色的情况下，通过颜色范围辨认不同细胞的原生质体，以及同种间细胞融合和异种间细胞融合情况。

PEG是一种高分子化合物，由于含有醚键而具有负极性，与水，蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连，在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合，高Ca2+高pH清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。

实验试剂

1.洗涤液：

甘露醇 0.6 M

CaCl2?2H2O 8 mM

NaH2PO4?H2O 2 Mm

Ph 5.6

实验步骤

1.酶液的制备 把纤维素酶（EAS－867）溶于0.5～0.7摩尔/升甘露醇内，加10毫摩/升氯化钙溶液作稳定剂。酶溶解后，经4000转/分离心机沉降原生质体，20分钟后，取上清液。经针筒型过滤器，再经0.45微米微孔滤膜过滤后，在无菌箱内把酶液分装在三角烧瓶内，贮存在冰箱里备用。

2.材料准备 把生长在温室，苗龄60天以上的烟草植株，取上中部全展叶，在日光下照射2小时，使它萎蔫。也可以用温室生长的蚕豆叶作同样处理，或用大田收获的胡萝卜，放在0℃以上低温备用。萎蔫后的叶片浸在3%的漂白精片溶液中15～20分钟，再用无菌水冲洗干净，用无菌吸水纸吸干表面水分。

3.酶解 用尖头镊子撕去叶片下表皮，剪成小块。胡萝卜则用刀片削去表皮和中柱，取用皮层部，切成小块。以上材料1克，放入盛有10毫升酶溶液的培养皿里，加盖。在28～30℃下保温1.5～3小时。

4.洗涤 叶片或其他组织经酶解后会出现圆形的游离原生质体，原生质体悬浮液内有未消化的组织、碎片、细胞和破裂的原生质体。用滤纸或尼龙布滤去粗杂质，再把原生质体悬浮液移到离心管，用手摇离心机转动2分钟，吸去上清液（见图），再加入0.5毫升甘露醇洗涤2～3次，最后就得到较为纯净的原生质体，可以供进一步培养或作其他实验用。

实验七 细胞融合方法

实验目的

1、初步掌握动物细胞PEG融合的方法。

2、学习细胞融合及其应用的有关知识。

实验原理

2个或2个以上的细胞合并为1个细胞的现象，称为细胞融合。细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇（PEG）法和电融合方法。

用PEG处理细胞，能使质膜性质发生改变，导致细胞膜融汇，胞质流通，最后导致细胞融合。

实验器材、材料与试剂

1、仪器：

光学显微镜，离心机，恒温水浴锅，C02培养箱，超净台，倒置显微镜等。

2、材料

新鲜鸡红细胞，无菌注射器，6号针头，刻度离心管，试管，载玻片，盖玻片。

3、试剂

50%PEG，Hanks液，甲醇，Giemsa染液，碘酒，75%乙醇

实验方法

(1)取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。

(2)称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。

(3)取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5ml Hanks液混匀，然后以1,000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。

(4)取上述50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后静置1分钟左右。此全部过程都要求在37℃水浴内进行。

(5)缓慢滴加9ml Hanks液以终止PEG的作用，在37℃水浴内静置5分钟。

(6)离心弃上清后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖片镜检。

数学建模，给我的题目出点建议

它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔**或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙AO常与溴化乙啶EB合用双染，因EB只染细胞使之产生桔**荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏细胞.它还可以用作移码突变的诱变剂,能镶嵌于两个相邻的碱基对之间，这样在DNA复制过程中，会使DNA链增加或缺失一个碱基，造成移码突变。吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。

好

流式细胞仪（B.D公司），DIAGNOSTIC INSTRUMENTS-SPOT INSIGH荧光摄像（USA）系统及MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70细胞内钙离子荧光成像（USA）测定系统。DMEM培养基(Gibco)、新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(1∶250 Difco，Gibco)、维拉帕米（verapamil，Ver）、二甲基亚砜（DMSO）、吖叮橙（AO）、A23187均为美国Sigma公司产品；Fluo-3/AM荧光探针（Eugene Oregon, USA）；其它试剂均为国产分析纯。采用胰蛋白酶消化法[5]。在无菌状态下，取角膜移植后的供体眼球（供体年龄限制24～38岁），在无菌PBS液中沿角巩膜缘后2mm处环形剪开，弃去眼前节及玻璃体，自视盘处分离视网膜神经上皮层，加入2.5g/L胰酶消化混合液，于37℃消化1h，加入含200mL/L新生牛血清DMEM的培养液，用吸管吹打RPE细胞面使细胞脱落，将含RPE细胞的液体移入离心管中，离心1 000r/min×8min，弃上清后，加入培养液，调整细胞密度1×105/L，将RPE细胞悬液接种于6孔板内，37℃，50mL/L CO2孵箱中培养。RPE传代培养同文献[6]，3～6代细胞用于本实验。

1.2方法 将第3代的hRPE细胞种植于内置盖玻片的24孔板中，加入Ver 80mg/L，作用12，24，48h后，取出玻片，与未加药的对照组，投入950mL/L乙醇中固定30min，微干，10mL/L醋酸作用30s，1×10-4吖啶橙（AO）染色1min，0.1mol/L氯化钙处理2min。PBS漂洗3次。且用PBS封片，荧光显微镜下直接观察，每孔重复3次。在4℃条件下离心，收集80mg/L Ver作用12，24，48h后及未加药的hRPE细胞5×106个/L，加入等量25g/L戊二醛固定，离心5min，弃去上清，移至离心管中，加入25g/L戊二醛固定，4℃作用30min。常规电镜固定包埋，柠檬酸铅染色，透射电镜上观察，摄片。以80mg/L浓度的Ver，作用12，24，48h后，收集2×106/L个细胞，离心1 000r/min×5min，PBS漂洗1次。离心去PBS，加入PI染液0.5mL，4℃避光作用30min。荧光染色剂PI用氩离子激发荧光，激光发光波长488nm，流式细胞仪采集数据，cellquest分析软件分析，通过计算凋亡区（亚二倍体区）细胞数量得出凋亡率。每个样本重复3次。将1×105/L细胞接种于3.5cm2的一次性培养皿中，待细胞80%融合后，加入终浓度80mg/L的Ver，作用12，24，48h，换液后，加入无血清DMEM液体1mL，加入终浓度10μmol/L FLUO-3/AM染色，37℃，50mL/L CO2孵箱内孵育45min，PBS充分洗去染料，室温静置15min后，置于MetaFluo4.5/coolsnapfx/IX70细胞内钙离子荧光成像测定系统操作台上，25℃测定单个细胞钙荧光强度，激发波长488nm，40倍物镜观察，每组计算20个单个细胞钙离子浓度，取其均值。加入A23187 5μmol测定最高荧光强度值， 加入0.2mmolMnCl2测定最低荧光强度值，细胞内钙浓度按[Ca2+]i＝Kd（Fmax-F）/（F-Fmin）公式计算，Kd＝400，Fmax为最强荧光值，Fmin为最低荧光值，F为测得细胞荧光值。

算是一篇吧！！！！！！