吖啶橙染色剂-吖啶橙染液配置

叶绿体足植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作川就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。实验目的一、通过植物细胞叶绿体的分离。了解细胞器分离的一般原理和方法。二．观察叶绿体的自发荧光和次生荧光．井熟悉荧光显微镜的使用方法。实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差迷离心，是分离细胞器的常用方法，一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗 粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4moJ/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5mia，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荣光．若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿索的火红色荧光和水质素的**荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片，益玻片和无荧光油。实验用品一、器材1、主要设备：普通离心机、组织捣碎机，粗天平、荧光显微镜。2、小型器材，500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。二、材料 新鲜菠菜三、试剂 0.35mol/L氯化钠溶O.01%吖啶橙(acridine orange)。实验方法1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml0.35mol/L NaCI溶液中，装入组织捣碎机。2、利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆3—5min。3、将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。4、取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。5、将上沾液在3000r/min下离心5rmin．弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞陔)。6、将沉淀用0.35mol/LNaCI溶液悬浮。7、取叶绿体悬液一消滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 ①在普通光镜下观察。

②在荧光显微镜下观察。

③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再漓加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可以荧光显微镜下观察。菠菜叶手切片观察 用剖须刀将新鲜的嫩菠菜切削一斜面置于载片上，滴加1--2滴0.35mol/LNaCI溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。 ①在普通光镜下观察。

②在荧光显微镜下观察。

③用同样方法制片，但滴加I--2滴0.01%吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加盖廾后即町以荧光显微镜下观察。实验结果一、叶绿体的分离和观察1、普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2、以Olympus荧光显微镜为例，在选用B(blue)激发滤片，B双色镜和O530(orange)阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。3、加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧色。二、菠菜叶手切片观察1、在普通光镜下可以看到三种细胞(1)表面细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。

(2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。

(3)叶肉细胞：为排成栅状的长方形和椭幽形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。2、在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。3、用吖啶橙染色后，叶绿体则发出枯红色荧光，细胞核町发出绿色荧光，气孔仍为绿色。附件列表

细菌有哪些染色方法？

吖啶橙：3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl?, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔**或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙AO常与溴化乙啶EB合用双染，因EB只染细胞使之产生桔**荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏细胞.它还可以用作移码突变的诱变剂,能镶嵌于两个相邻的碱基对之间，这样在DNA复制过程中，会使DNA链增加或缺失一个碱基，造成移码突变。吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。

一、常用的染色方法有革兰氏染色(最基本)、芽孢染色、荚膜染色、鞭毛染色等。

二、.1 革兰染色法 （1）取含金**葡萄球菌和大肠埃希菌的混合菌液涂片、干燥、固定;（2）染色:用结晶紫染液染1min，水冲洗;卢戈碘液染1min，水冲洗;0.4%复红酒精溶液染30s，水冲洗;（3）吸干后镜检［2］ 。

1.2 抗酸染色法 （1）取结核杆菌阳性的痰标本（已处理）涂片、干燥、固定。（2）染色:将石炭酸复红染液沸水浴10min，滴加2～3滴覆盖菌膜染色 5min，水冲洗，3%盐酸酒精脱色30s，水冲洗;碱性美兰复染30s，水冲洗。（3）吸干后镜检［3］ 。

1.3 荚膜染色法 （1）取接种肺炎球菌亡的小鼠腹腔液涂片、干燥、固定;（2）染色:用石炭酸复红染液染1min，水冲洗;95%酒精脱色5s水冲洗;20%鞣酸溶液媒染10min水冲洗;0.8%孔雀绿溶液染色1min，水冲洗;（3）吸干后镜检［4］ 。

1.4 芽胞染色法 （1）取等量破伤风杆菌厌氧培养菌液和5%孔雀绿水溶液，放入小试管中充分混合，沸水浴20min;取上述混合液涂片、干燥、固定;（2）用 1%沙黄液复染10min，水冲洗;（3）干后镜检。

2.1 革兰染色 镜下，金**葡萄球菌染成紫色、球形，为革兰阳性菌;大肠埃希菌染成红色、杆状，为革兰阴性菌。革兰染色法是细菌学中最经典，应用最广泛的染色法之一。脱色是影响革兰染色的关键步骤，脱色时间长短直接关系到染色结果的准确性［5］ 。脱色过度则革兰阳性菌可能被误染为革兰阴性菌，脱色不 够则革兰阴性菌可能被误染为革兰阳性菌，为此学生难以把握。现将原有四步染色法改为三步法，即把第三步酒精脱色和第四步复红复染合并一步进行，使用 0.4%复红酒精溶液作为复染剂，可达到脱色和复染双重目的。这样，就可以避免学生在四步法中因脱色时间不易掌握而造成染色的失败，减少重复性实验，提高了教学效果。

2.2 抗酸染色 镜下，结核分枝杆菌染成红色，为抗酸菌;背景和其他菌被染成蓝色，为非抗酸菌。传统的方法是滴加石炭酸复红染液于涂片上，用玻片夹夹住涂片以微火烟叶热，保持染液冒蒸汽约5min，此法学生容易使染液蒸干或使染液沸腾，从而影响染色效果和污染环境。改良后的方法是将染液直接加热改为水浴后使用，克服上述的缺点，且染色效果良好。适合实验教学使用。

2.3 荚膜染色 镜下，肺炎球菌菌体染成红色（成双排列），荚膜染成绿色，存在于菌体的周围。传统的荚膜染色是用结晶紫染液染色，菌体染成紫色，荚膜染成淡紫色或无色，菌体和荚膜之间反差小，不易分辨。改良后，增加了脱色、媒染、复染的步骤，使菌体和荚膜之间反差增大，易于观察，可用于学生实验和示教片的制作。

2.4 芽胞染色 镜下，破伤风杆菌的菌体染成红色，芽胞染成绿色。传统的方法是滴加石炭酸复红染液于涂片上并弱火加热，使染液冒蒸汽约5min，此法染液用量大，且容易污染衣物和实验台。现改为菌液和染液混合水浴加热初染，然后制备涂片、固定、复染，即节约时间，染液消耗又少，且菌体、芽胞对比鲜明。此法适用于教学标本片的制作。

三、简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

操作步骤

1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。

2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。

3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。

4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。

5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。

6．干燥

7．镜检