吖啶的用途-吖啶的供体

2024-11-07 23:50:08

吖啶的用途-吖啶的供体

三、RNA引物

目前所发现的DNA聚合酶都需要一个具3′-OH的引物，才能将合成原料dNTP一个一个接上去。因为DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP在DNA模板上进行聚合，如图12-3所示。实验又发现抑制RNA聚合酶的药物如利福霉素(rifampicin)能抑制DNA的复制。再者在体外DNA复制实验中发现冈崎片段的5′端都有一小段4~12个核苷酸的RNA引物(RNA primer)。现知RNA聚合酶合成新链时不需要引物，能直接催化游离NTP聚合。可见RNA引物为DNA聚合酶提供聚合新核苷酸所需的3′-OH。RNA引物最后被DNA聚合酶Ⅰ除去，留下的空隙也由该酶补满，缺口再由DNA连接酶封口。

在DNA的复制需要RNA引物呢，除了DNA聚合酶不能催化两个游离dNTP的聚合，而RNA引物酶却具有此能力外，这种作用尚可尽量减少DNA复制起始处的突变。因为游离核苷酸起始处的聚合最容易出现差错，若用RNA引物，即使出现差错，由于最后将被DNA聚合酶Ⅰ切除，便可提高DNA复制的真实性。

四、引发体

引发体(primosome)是由多种蛋白质及酶组成，是DNA复制开始所必需的。引发体中的某些蛋白质如DnaA能结合至DNA复制起始部位，DnaB具有解链酶的作用，DnaC辅助DnaB结合到复制起始点，使起始部位的双链解开。而引发体中的引物酶(primase)在已解开起始部位的DNA单链按碱基互补配对催化NTP聚合，合成一小片段的RNA，作为DNA合成的引物，即沿此引物RNA的3′-OH进行延伸。

四、真核生物端粒DNA的复制

真核生物线性染色体的两个末端称为端粒(telomere)。按上述DNA复制机制新合成子链5′端的那段RNA引物被切除后，必留下一个空缺，假如每次细胞分裂或DNA复制都是如此，端粒将会不断缩短，最终导致关键基因的丧失及种系灭绝的危险，但事实并非如此。那么真核生物一定存在着某种阻止端粒缩短的机制。

(一) 端粒DNA的结构和端粒酶

对端粒DNA序列的分析，发现端粒DNA的3′端是由数百个串联重复GT丰富的短的寡核苷酸序列，如四膜虫的重复序列为-GGGGTT-，人为-AGGGTT-。端粒DNA序列虽不含功能基因，但对维持染色体的稳定性起着重要作用。如果端粒丧失，染色体之间可能出现端-端融合、降解、重排乃至染色体丢失等变化，最后细胞衰亡。

近年来，发现了一种能防止端粒缩短的酶，称为端粒酶(telomerase)，该酶由蛋白质和RNA两部分组成，其中RNA作为合成端粒DNA的模板，端粒酶是目前所知唯一携带RNA模板的逆转录酶，具有种属特异性，例如四膜虫的端粒酶，其RNA部分含159个核苷酸，其中有一段序列为5′-CAACCCCAA-3′可作为合成端粒DNA3′端GT 丰富序列-GGGGTT-模板。人端粒酶的RNA含450个碱基，其中-CUAACCCUAAC-为合成-AGGGTT-的模板。这样可防止细胞分裂时DNA复制端粒的缩短。

端粒、端粒酶和细胞的衰老有密切关系。有人将端粒称为分子钟或有丝分裂钟。但是恶性肿瘤细胞当端粒缩短到某种程度，端粒酶活性又重新出现，对端粒进行补偿，使之永不衰亡，形成恶性增殖。

(二) 端粒酶的作用机制

第四节DNA的损伤与修复

DNA是储存遗传信息的物质。从生物遗传角度来讲，要求在复制过程中保持遗传密码的稳定性，物种才能得以延续。哺乳动物单倍体细胞的基因组由2.9X109 bp DNA组成。动物一生中，从受精卵细胞到个体亡，这些遗传密码要经过千万次的复制。在物种进化的长河中，DNA复制的次数更是难以计数，而且生物体内外环境都存在着使DNA损伤（DNA damage）的因素。可见，除DNA复制的高度真实性外，还要求某种修复DNA损伤的机制。每一遗传信息都以不同拷贝储存在DNA两条互补链上。因此，若一条链有损伤，可被修复酶切除，并以未损伤的信息重新合成与原来相同的序列，这就是DNA修复（DNA repair）的基础。

但是在漫长的进化过程中，DNA的序列还是会发生改变, 通过复制传递给子代成为永久的，这种DNA的核苷酸序列永久的改变称为突变(mutation)。若发生的突变有利于生物的生存则保留下来，这就是进化；若不适应于自然选择(nature selection)则被淘汰，因此生物的进化可以看成是一种主动的基因改变过程，这是物种多样性的原动力。所以，生物的变异是绝对的，修复是相对的。

一、造成DNA损伤的因素

造成DNA损伤的因素有生物体内自发的、亦有外界物理和化学等因素。

(一) 自发的因素

由于DNA分子受到周围环境溶剂分子的随机热碰撞(thermal collision)，腺嘌呤或鸟嘌呤与脱氧核糖间的N-糖苷键可以断裂，使A或G脱落。人体细胞中DNA每天每个细胞要脱落5 000个嘌呤碱，每天每个细胞也有100个胞嘧

啶自发脱氨而成尿嘧啶。

(二) 物理因素

1．紫外线损伤由于嘌呤环与嘧啶环都含有共轭双键，能吸收紫外线而引起损伤。嘧啶碱引起的损伤比嘌呤碱大10倍。损伤是由于嘧啶二聚体的产生，即2个相邻嘧啶碱的C5和C6共价交联，如图12-18所示。

2．电离辐射损伤如X射线和γ射线，可以是辐射能量直接对DNA的影响，或DNA周围的溶剂分子吸收了辐射能，再对DNA产生损伤作用。如碱基的破坏、单链的断裂、双链的断裂、分子间的交联、碱基脱落或核糖的破坏等。

(三) 化学因素

二、DNA损伤的类型

根据DNA分子的改变，可把突变分为下面几种主要类型。

点突变

点突变(point mutation)是DNA分子上一个碱基的变异，可分为：①转换(transition)同型碱基，如一种嘌呤代替另一种嘌呤或一种嘧啶代替另一嘧啶。②颠换(transversation)异型碱基，即嘌呤变嘧啶，或嘧啶变嘌呤。点突变可根据发生在DNA分子的部位，如发生在启动子或剪接信号部位可以影响整个基因的功能；若发生在编码序列，有的可以改变蛋白质的功能如引起镰状红细胞贫血；有的则为中性变化，即编码氨基酸虽变化，但功能不受影响；有的甚至是静止突变，碱基虽变但编码氨基酸种类不变。

缺失

缺失(deletion)是一个碱基或一段核苷酸链乃至整个基因，从DNA大分子上丢失。如有些地中海贫血、生长激素基因缺失，再如上述Lesch- Nyhan综合征是HGPRT基因缺失。

（三）插入

插入(insertion)是一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸序列插入到DNA大分子中去，或有些芳香族分子如吖啶(acridine)嵌入DNA双螺旋碱基对中，可以引起移码突变(frame-shift-mutation)，影响三联体密码的阅读方式。

（四）倒位

DNA链内部重组，使其一段方向颠倒。

三、修复机制

光修复机制

这种机制主要存在于低等生物。

1. 不需要光复活酶

光复活酶(photoreactivating enzyme)也称为DNA光修复酶(photolyase)。当280nm紫外线照射DNA产生的嘧啶二聚体，在短波239nm照射下，二聚体即分解成单体。

2. 需要光复活酶紫外线照射使光复活酶激活，能解聚嘧啶二聚体。

切除修复

因不需要光照射，故也称暗修复。DNA引起大的损伤, 包括UV引起的嘧啶二聚体、嘧啶/ 环丁烷二聚体、几个其它类型的碱基加合物、通过曝露于香烟的烟尘在DNA中形成的苯并芘尿嘧啶。一般由切除修复(excision repair)系统修复。该修复途径对所有生物的生存是关键的。在大肠杆菌E.coli中，有一种UV特异的切割酶(excinuclease或UVrABC enzyme)，能识别UV照过产生的二聚体部位。并在远离损伤部位5′端8个核苷酸处及3′端4个核苷酸处各作一切口。像外科手术“扩创”一样，将含损伤的一段DNA切掉。DNA聚合酶Ⅰ进入此缝隙，从3′-OH开始，按碱基配对原则以另一条完好链为模板进行修复。最后由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来DNA链连接而封口 (图12-19) 。真核细胞的切割核酸酶的作用和机制，是与细菌的酶完全类似的方式对嘧啶二聚体切割。切除修复是人体细胞的重要修复形式，有些遗传性疾病如着色性干皮病(xeroderma pigmentosum)，是常染色体隐性遗传性疾病。纯合子患者的皮肤对阳光或紫外线极度敏感，皮肤变干、真皮萎缩、角化、眼睑结疤、角膜溃疡，易患皮肤癌。此病是由于缺乏UV特异内切核酸酶造成的。

(三) 碱基切除修复

每个细胞都有一类DNA糖苷酶(DNA glycosylase)，每一种酶能识别一种DNA分子中改变的碱基，能水解该改变的碱基与脱氧核糖间的糖苷键，使改变的碱基脱落，在DNA上产生一个缺嘌呤或缺嘧啶的位（apurinic-or apyrimidinic-site，AP site）,再藉切除修复机制进行修复。现知至少有20种不同的DNA糖苷酶，各具特异性。如识别胞嘧啶脱氨生成的尿嘧啶，腺嘌呤脱氨基产物，开环的碱基，不同烷基化类型的碱基等。如胞嘧啶脱氨后即成尿嘧啶，若不纠正，可引起类型转换，即G-C→A-T。

碱基切除修复（base-excision repair）步骤如下：

1)DNA糖苷酶识别损伤的碱基,在碱基和脱氧核糖之间切割。

2）AP核酸内切酶切AP位置附近的磷酸二酯键。

3）DNA聚合酶Ⅰ用它的5′→3′外切酶活性除去损伤链,从缺口的3′-OH起始

修复合成,用新合成的DNA替代。

4）最后缺口由DNA连接酶封口(图12-20)。

尿嘧啶DNA糖苷酶修复的发现，解答了一个长年以来的疑题，即组成RNA是U，而组成DNA却是甲基化为T，即从UMP→dTMP，要消耗能量。但U和T都与A互补配对，所编的密码是相同的。生物体为什么花如此代价? 现在问题清楚了，尿嘧啶-DNA糖苷酶只能切除DNA链上的尿嘧啶，而不能切除DNA链上的胸腺嘧啶，因为后者C5有一甲基，好像是给尿嘧啶加上一个标签。胞嘧啶脱氨基后形成的尿嘧啶即无此标签，即被该糖苷酶识别为改变了的碱基。若DNA与RNA一样也用尿嘧啶，那么胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶，与正常部位的尿嘧啶便无法区别，不能纠正，造成子代DNA的突变即GC→AT。可见DNA由T代替U，能增加遗传信息的稳定性。相反，RNA不需修复，拷贝数很多，半衰期短，即使有个拷贝的胞嘧啶脱氨基转变为U，影响也不大，合成出来的绝大多数蛋白质还是具有正常生理功能，而且U作为合成原料经济得多。

第五节重组DNA技术

DNA重组(recombination of DNA)是自然界常见现象，指的是在两个DNA分子之间，或一个DNA分子的两个不同部位之间通过链断裂和片段的交换重接，改变了基因的组合序列。这种交换可发生于同一细胞内或细胞间，甚至不同物种的DNA。DNA重组现象广泛存在于真核细胞、原核细胞乃至病毒和质粒。

本节所要介绍的重组DNA技术或基因工程(genetic engineering)，是70年代由Stanford大学Boyer、Cohen和Berg等科学家建立的一种革命性的技术方法，它是在实验室内用人工方法将不同来源，包括不同种属生物的DNA片段，拼接成一个重组DNA(recombinant DNA)分子，将其引入活细胞内，使其大量复制或表达。这种技术方法称为重组DNA技术。由于它可以把一个生物体中携带的某一特定的遗传信息(基因)，通过一定的方法转移到另一生物体中，使之获得前者的遗传特征，创造新的遗传组合，所以又称为基因工程，若从遗传角度来考虑也可称为遗传工程。重组DNA技术中所含有的目的DNA分子或基因需进行无性繁殖、扩增成为一个克隆(clone)，因此基因工程在不同的场合又可有不同的名称，如分子克隆(molecular cloning)、DNA克隆、基因克隆等。

4．聚合酶链反应(PCR)扩增DNA片段或cDNA

以已有DNA为模板，通过PCR扩增出所需片段。另可以mRNA为模板，采用逆转录酶PCR进行扩增，得到所需要的cDNA。(详见下节)。

(二) 载体

欲将外源基因或DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达，需要通过一个能在宿主细胞中进行自我复制并表达目的基因的载体(vector)的介导，目的DNA与载体在体外构成重组DNA分子，然后导入宿主细胞，进行扩增及表达。以大肠杆菌作为宿主细胞的载体有：质粒、λ噬菌体、粘粒和M13噬菌体等。这些载体分为克隆用和表达用不同种类，有些还含有在真核细胞中生活及基因表达必须的成分，供不同实验目的选用，多数已作为商品供应。

1. 克隆载体(vector of clone)

(1)质粒质粒(plasmid)是细菌染色体外小的双链闭环的DNA分子，能自主复制，并含有抗药性基因。

较理想的质粒应符合下列条件：

1) 要有多个单切口的限制性内切酶的位点，而且外源DNA片段插入后，不影响质粒的复制。

2) 含有抗药性或其他可供筛选的标志，外源DNA插入后，抗药性消失，或其他酶活性丧失。

3) 含有高效的自主复制序列，这样在宿主细胞中质粒复制的拷贝数多。若含有能在真核细胞生活的序列，这种载体则能在真核细胞中生活及表达。pBR322是一种最常用、最基础的质粒。通过人工构建而成，其结构如图12-22所示。大小：4363bp抗药性基因：有两个。氨苄青霉素抗性 (ampicillin resistance,ampR)基因编码β-内酰胺酶(β-1actamase)，能切开氨苄青霉素的内酰胺环，从而使之失效。若在此基因中插入外源DNA片段，即破坏该酶的结构。另一四环素抗性(tetracycline resistance,ampR)基因，编码一种蛋白质，能改变细菌膜的状态，阻止四环素进入细胞而赋予宿主抗四环素的能力。若

该基因被外源DNA插入即失活。自主复制(ori)成分(序列),使pBR322在大肠杆菌内能高效进行复制，产生多拷贝。

另一些质粒如pUC系统，除含ampr基因外，还含大肠杆菌的lacZ基因也常被用作为选择的标记。此基因编码β半乳糖苷酶。LacZ位于多位点接头(polylinker)上。有的还含有高效的启动子。

(2) λ噬菌体λ噬菌体(bacteriophage λ)为线状双链DNA病毒(约50kb)，感染大

肠杆菌。经改造的噬菌体有一、二个EcoRⅠ切点，并含有LacZ基因作为筛选的标志。当中的1/3序列不是病毒生活所必需，可以去除，而由外源DNA片段(5~25kb)替代。如图12-23所示。

β-半乳糖苷酶能分解一种化学品称为5-溴-4-氯-3吲哚-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro

-3-indolyl-galactoside，X-gal)，X即为5-bromo-4-chloro-3-indolyl，是一发色(蓝色)基团，当它与半乳糖以糖苷键结合时即为无色。但是X-gal经β-半乳糖苷酶作用后即将X基团释放出来而成蓝色。若LacZ被插入的DNA片段破坏，则不能产生β-半乳糖苷酶，因此在含有X-gal的培养基中成为无色的斑点。若LacZ完整，X-gal被β-半乳糖苷酶分解而成为蓝色的斑点，故可作为筛选的标志。

(3) 其他

2. 表达载体（expression vector）

表达载体是带有调控克隆基因表达必需的转录和翻译信号的克隆载体。克隆基因在细菌和其它细胞中的过量表达，能够产生大量的特异蛋白质。

（1）大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体（E.coli expression vector）除具有克隆载体所具备的性质以外，还带有控制在大肠杆菌中表达元件即转录和翻译所必需的DNA序列 : 启动子、操纵基因、编码阻遏物的基因、核糖体结合位点、转录终止信号。

（2）真核表达载体真核表达载体（eukaryotic expression vector）含有必不可少的原核序列，如在大肠杆菌中能够作用的复制子，便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因。但在质粒中还包括在真核细胞中生活和表达元件：启动子/ 增强子、克隆位点、终止信号和加poly(A) 信号、剪接供体和受体、复制起始点和选择标记基因。

(三) 工具酶

限制性内切酶(restriction enzyme或restriction endonuclease)，DNA连接酶、末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)、逆转录酶、S1核酸酶(切单链DNA或RNA)、碱性磷酸酶等均属工具酶。限制性内切酶是重组DNA技术中最关键的工具酶，现着重加以介绍。

限制性内切酶是微生物的一种自我保护的酶，它能识别双链DNA分子中特异碱基序列并切开。所以当外源DNA侵入细菌体时，细菌体为保护自身DNA的完整性，通过其所含的特有的限制性内切酶对外源DNA进行酶解，而自身的DNA分子中所含该限制性内切酶的识别碱基序列则被另一种酶进行甲基化而保护起来，故不被自己的限制性内切酶所切断。

限制性内切酶识别的DNA序列多数为4~6个碱基，新近发现一些能识别8个碱基的。识别碱基数少的酶对DNA切的机率多，碱基数大则少。所以识别8个碱基序列的酶，可用于分析大片段DNA，可切成上百乃至上千kb的片段。限制性内切酶的识别序列都具有回文或双重对称结构的特点。

切口：有两种切口。一种切开后，即成黏性末端(cohesive ends或sticky ends)，因为两个末端的碱基互补配对，易通过氢键相连。

有些限制性内切酶的切口，成为平头末端(blunt ends)

不同的DNA分子上若有某一种限制性内切酶的位点，均能被该酶切断，并产生相同的切口，这对重组DNA分子很有利。

拼接方法：

1. 黏性末端

2．均聚体尾部 (homopolymeric tailing)

3．化学合成的接头 (chemical synthetic linker)

三、重组DNA分子引入宿主细胞

(一) 原核细胞

最常用的是大肠杆菌，要选择合适的菌株(strain)。宿主细胞先经氯化钙处理，以改变细胞膜的通透性，使重组DNA分子容易进入。这种将重组质粒DNA分子引入细菌，使其在细菌体内扩增及表达的过程称为转化 (transformation)。

(二) 动物细胞

宿主细胞主动摄取或被动引入外源DNA片段或重组DNA分子的过程称为转染(transfection)。进入细胞内的DNA可以被整合至宿主的基因组中，也可以在染色体外生活表达，这就需要采用含有能在真核细胞生活的结构成分的载体。可用磷酸钙介导(calcium-phosphate mediated)使外源DNA形成沉淀颗粒，颗粒若沉着在动物细胞的表面，以利细胞将这些颗粒摄入。近年用脂质体(1iposome)介导外源DNA的转移，可提高转染效率。用电穿孔(electroporation)方法，将外源DNA与宿主细胞放入特别的装置内，在高压电脉冲作用下，细胞外的DNA分子会在细胞膜上穿孔而入，并最终进入细胞核内，整合至宿主基因组中。用基因枪（颗粒轰击particle bombardment）方法是将外源DNA包裹了化学性质稳定的金或钨微粒以后，在电子发射装置或高压气流的驱动下，以极高速度打入受体细胞，组织和器官中，以进行基因转移技术。

用逆转录病毒(retrovirus)作为载体可以成功地感染动物细胞。另外可用微注射(microinjection)的方法，将外源DNA分子直接注射入细胞内或核内。近年发展一种转基因(transgenic)小鼠方法，即将重组DNA分子注射于单细胞受精卵的原核内，然后再将其植入一假妊娠母鼠的子宫内。生下的小鼠在全身各组织细胞的基因组DNA中都含有这种外源DNA，可以研究在整体条件下外源DNA的功能。

抗急性白血病的治疗是怎样的？

抗白血病治疗的第一阶段是诱导缓解治疗，化学治疗是此阶段白血病治疗的主要方法。目标是使患者迅速获得完全缓解（CR），所谓CR，即白血病的症状和体征消失，外周血中性粒细胞绝对值≥1.5*10^9/L，血小板≥10010^9/L，白细胞分类中无白血病细胞；骨髓中原始粒Ⅰ型＋Ⅱ型（原单+幼单或原淋+幼淋）≤5%，M3型原粒＋早幼粒≤5%，无Auer小体，红细胞及巨核细胞系列正常，无髓外白血病。

理想的CR为初诊时免疫学、细胞遗传学和分子生物学异常标志消失。

达到CR后进入抗白血病治疗的第二阶段，即缓解后治疗，主要方法为化疗和造血干细胞移植（HSCT）。诱导缓解获CR后，体内仍有残留的白血病细胞，称之为微小残留病灶（MRD）。此时，急性白血病体内白血病细胞的数量大约由发病时的1010～1012/L降至108～109/L；同时中枢神经系统、眼眶、睾丸及卵巢等髓外组织器官中，由于常规化疗药物不易渗透，也仍可有白血病细胞浸润。

为争取患者长期无病生存（DFS）和痊愈，必须对MRD进行CR后治疗，以清除这些复发和难治的根源。

（1）急性淋巴细胞白血病治疗。随着支持治疗的加强、多药联合方案的应用、大剂量化疗和HSCT的推广，成人急性淋巴细胞白血病的预后已有很大改善，CR率可达到80%～90%。急性淋巴细胞白血病治疗方案选择需要考虑年龄、急性淋巴细胞白血病亚型、治疗后的MRD和耐药性、是否有干细胞供体及靶向治疗的药物等。

①诱导缓解治疗。长春新碱（VCR）和泼尼松（P）组成的VP方案是急性淋巴细胞白血病诱导缓解的基本方案。VP方案能使50%的成人急性淋巴细胞白血病获CR，CR期3～8个月。VCR主要毒副作用为末梢神经炎和便秘。VP加蒽环类药物（如柔红霉素，DNR）组成DVP方案，CR率可提高至70%以上，但蒽环类药物有心脏毒性作用，对儿童尤甚。DNR、阿霉素、去甲氧柔红霉素（IDA）、表柔比星的累积量分别达1000mg/m2、500mg/m2、300mg/m2和900mg/m2时，心脏毒性风险为1%～10%。DVP再加门冬酰胺酶（L-ASP）即为DVLP方案，L-ASP提高患者DFS，是大多数急性淋巴细胞白血病采用的诱导方案。L-ASP的主要副作用为肝功能损害、胰腺炎、凝血因子及白蛋白合成减少和过敏反应。

在DVLP基础上加用其他药物，包括环磷酰胺（CTX）或阿糖胞苷（Ara-C），可提高T-ALL的CR率和DFS。成熟B-ALL和ALL-L3型采用含大剂量（HD）CTX和HDMTX（甲氨蝶呤）方案反复短程强化治疗，总生存率已由不足10%达到50%以上。伴有t（9；22）的急性淋巴细胞白血病可以合用伊马替尼进行靶向治疗。

②缓解后治疗。缓解后强化巩固、维持治疗和中枢神经系统白血病（CNSL）防治十分必要。如未行异基因HSCT，急性淋巴细胞白血病巩固维持治疗一般需3年。定期检测MRD并根据亚型决定巩固和维持治疗强度和时间。L-ASP和HDMTX已广为应用并明显改善了治疗结果。HDMTX的主要副作用为黏膜炎、肝肾功能损害，故在治疗时需要充分水化、碱化和及时亚叶酸钙解救。大剂量蒽环类、依托泊苷和Ara-C在巩固治疗中作用，尤其是远期疗效仍待观察。

对于急性淋巴细胞白血病，即使经过强烈诱导和巩固治疗，仍需维持治疗。巯嘌呤（6MP）和MTX联合是普遍采用的有效维持治疗方案。

一般控制白细胞在3*10^9/L以下，以控制MRD。为预防CNSL，鞘内注射MTX10mg，每周一次，至少6次。

复发指CR后在身体任何部位出现可检出的白血病细胞，多在CR后两年内发生，以骨髓复发最常见。此时可选择原诱导化疗方案再诱导，如DVP方案，CR率可达29%～69%。若选用HDAra-C联合米托蒽醌（NVT）或其他药物如氟达拉滨，效果更好。如复发在首次CR期18个月后，再次诱导化疗缓解概率相对高。但急性淋巴细胞白血病一旦复发，不管采用何种化疗方案和再缓解率多高，总的二次缓解期通常短暂（中位2～3个月），长期生存率

髓外白血病中以CNSL最常见。单纯髓外复发者多能同时检出骨髓MRD，血液学复发会随之出现。因此在进行髓外局部治疗的同时，需行全身化疗。对CNSL预防有颅脊椎照射和腰穿鞘注两种方法。颅脊椎照射疗效确切，但其不良反应继发肿瘤、内分泌受损、认知障碍和神经毒性限制了应用。现在多采用早期强化全身治疗和鞘注预防CNSL发生，以省略颅脊椎照射，将其作为CNSL发生时的挽救治疗。一旦发生CNSL，未接受过照射者采用HDMTX（或HDAra-C）联合CNS照射，至少半数病例有效；否则可联合鞘内给药。

不过，有照射史的CNSL，鞘内给药的有效率仅30%。要注意此类治疗的中枢神经毒性（如白质脑病）作用。对于睾丸白血病患者，即使仅有单侧睾丸白血病也要进行双侧照射和全身化疗。

HSCT对治愈成人急性淋巴细胞白血病至关重要。异基因HSCT可使40%～65%的患者长期存活。主要适应证为：复发难治急性淋巴细胞白血病；CR2期急性淋巴细胞白血病；CR1期高危急性淋巴细胞白血病：如染色体为t（9；22）、t（4；11）、＋8者；WBC>30*10^9/L的前B-ALL和100*10^9/L的T-ALL；获CR时间>4～6周，CR后MRD偏高，在巩固维持期持续存在或仍不断增加。

（2）急性髓细胞白血病治疗。近年来，由于强烈化疗、HSCT及有力的支持治疗，60岁以下急性髓细胞白血病患者的预后有很大改善，30%～50%的患者可望长期生存。

①诱导缓解治疗。

DA（3+7）方案：DNR每日45mg/m2静脉注射，第1～3天；每日Ara-C100mg/m2，持续静脉滴注，第1～7天。60岁以下患者，总CR率为63%（50%～80%）。用NVT每日8～12mg/m2替代DNR，效果相等，但心脏毒性低。用IDA每日12mg/m2代替DNR，年轻患者中CR率增加。IDA+Ara-C+VP16联合应用可使年轻急性髓细胞白血病患者获得80%CR率。HDAra-C方案不增加CR率，但对延长缓解期有利。剂量增加的诱导化疗能提高疗程CR率和缓解质量，但相关毒性亦随之增加。国内创用HOAP或HA（高三尖杉酯碱每日3～6mg，静脉滴注5～7天）方案诱导治疗急性髓细胞白血病，CR率为60%～65%。1个疗程获CR者DFS长，经过2个疗程诱导才达CR者5年DFS仅10%。达CR所用的诱导时间越长则DFS越短。2个标准疗程仍未CR者提示患者原发耐药存在，需换方案或进行异基因HSCT。

急性早幼粒细胞白血病患者采用ATRA每日25～45mg/m2口服治疗直至缓解。ATRA可诱导带有t（15；17）（q22；q21）/PML-RARα融合基因的早幼粒白血病细胞分化成熟。ATRA＋化疗的CR率为70%～95%，同时降低“维A酸综合征”的发生率和亡率。

维A酸综合征多见于急性早幼粒细胞白血病单用ATRA诱导过程中，发生率为3%～30%，发生机制可能与细胞因子大量释放和黏附分子表达增加有关。临床表现为发热、体重增加、肌肉骨骼疼痛、呼吸窘迫、肺间质浸润、胸腔积液、心包积液、皮肤水肿、低血压、急性肾功能衰竭甚至亡。初诊时白细胞较高及治疗后迅速上升者易发生ATRA综合征。治疗包括暂时停服ATRA，吸氧，利尿，地塞米松10mg静脉注射，每日2次，白细胞单采清除和化疗等。

ATRA的其他不良反应为头痛、颅内压增高、骨痛、肝功能损害、皮肤与口唇干燥、阴囊皮炎溃疡等。急性早幼粒细胞白血病常伴有原发纤溶亢进，合并出血者除服用ATRA外，还需抗纤溶治疗，补充凝血因子和血小板。如有弥散性血管内凝血，可酌情应用小剂量肝素。对高白细胞的急性早幼粒细胞白血病，也可将砷剂作为一线药物。砷剂小剂量能诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化、大剂量则诱导其凋亡。成人用0.1%的As2O3（亚砷酸）注射液10ml稀释于5%GS或NS250～500ml中静脉滴注3～4小时，儿童剂量按体表面积每日6mg/m2，每日一次，4周为一疗程，每疗程可间隔5～7天，亦可连续应用，连用2个月未CR者应停药。

②缓解后治疗。诱导CR是急性髓细胞白血病长期DFS关键的第一步，但此后若停止治疗，则复发几乎不可避免。复发后不行HSCT则生存者甚少。急性髓细胞白血病缓解后治疗的特点为：急性髓细胞白血病的CNSL发生率仅2%，初诊高白细胞、伴髓外病变、M4/M5、t（8；21）或inv（16）、CD7+和CD56+者应在CR后做脑脊液检查并鞘内预防性用药。国内多数单位在急性髓细胞白血病CR后仍将CNSL预防列为常规，鞘内注药至少1次，但较急性淋巴细胞白血病预防次数明显减少；急性髓细胞白血病比急性淋巴细胞白血病治疗时间明显缩短，急性早幼粒细胞白血病用ATRA获得CR后采用化疗与ATRA或砷剂交替维持治疗2～3年较妥。

高危组首选异基因HSCT；低危组（不含APL）首选HD Ara-C为主的强烈化疗，复发后再行异基因HSCT；中危组强化疗、大剂量化疗+自体HSCT或同胞相合HSCT均可。值得注意的是在属于中危组的正常核型急性髓细胞白血病中，也存在基因突变，NPM1和CEBPA突变对预后有利，而FLT3-ITD、MLL-PTD突变等对预后不利。

HDAra-C方案巩固强化，每剂Ara-C静脉滴注3小时，连用～12个剂量，可单用或与安吖啶、NVT、DNR、IDA等联合使用。

急性髓细胞白血病用HDAra-C巩固强化至少4个疗程，或1次HDAra-C后行自身HSCT，长期维持治疗已无必要。HDAra-C的最严重并发症是小脑共济失调，发生后必须停药。皮疹、发热、眼结膜炎也常见，可用糖皮质激素常规预防。因贫困，年龄>55岁或有并发症不能采用上述治疗者，也可用常规剂量的不同药物组成化疗方案，每1～2个月轮换巩固维持2年，但仅约10%～15%的患者能够长期生存。

③复发和难治急性髓细胞白血病的治疗。

HDAra-C联合化疗：对年龄55岁以下，支持条件较好者，可选用之。

新方案：如氟达拉滨、Ara-C和G-CSF盜DA（FLAG盜）。

对于年龄偏大或继发性急性髓细胞白血病，可采用预激化疗：

G-CSF每日300μg皮射，1～14天；阿克拉霉素每日20mg，静脉注射，1～4天；Ara-C10～15mg/m2，每12小时1次，皮射，1～14天。

HSCT：除HLA相合的HSCT外，还包括HLA部分相合或半相合的移植。

免疫治疗：非清髓性干细胞移植（NST）、供体淋巴细胞输注（DLI）、抗CD33和CD45单抗也显示了一定的疗效。

（3）老年急性白血病的治疗。大于60岁，由MDS转化而来、继发于某些理化因素、耐药、重要器官功能不全、不良核型者，更应强调个体化治疗。多数患者化疗需减量用药，以降低治疗相关亡率，少数体质好，支持条件佳者可采用类似年轻患者的方案治疗，有HLA相合同胞供体者可行NST。

菌种选育的自然选育

抗白血病治疗的第一阶段是诱导缓解治疗，化学治疗是此阶段白血病治疗的主要方法。目标是使患者迅速获得完全缓解（CR），所谓CR，即白血病的症状和体征消失，外周血中性粒细胞绝对值≥1.5×109/L，血小板≥ 100×109/L，白细胞分类中无白血病细胞；骨髓中原始粒Ⅰ型＋Ⅱ型（原单+ 幼单或原淋+ 幼淋）≤ 5%，M3 型原粒＋早幼粒≤ 5%，无Auer 小体，红细胞及巨核细胞系列正常，无髓外白血病。

理想的CR 为初诊时免疫学、细胞遗传学和分子生物学异常标志消失。

达到CR 后进入抗白血病治疗的第二阶段，即缓解后治疗，主要方法为化疗和造血干细胞移植（HSCT）。诱导缓解获CR 后，体内仍有残留的白血病细胞，称之为微小残留病灶（MRD）。此时，急性白血病体内白血病细胞的数量大约由发病时的1010 ～ 1012/L 降至108 ～ 109/L；同时中枢神经系统、眼眶、睾丸及卵巢等髓外组织器官中，由于常规化疗药物不易渗透，也仍可有白血病细胞浸润。

为争取患者长期无病生存（DFS）和痊愈，必须对MRD 进行CR 后治疗，以清除这些复发和难治的根源。

（1）急性淋巴细胞白血病治疗。随着支持治疗的加强、多药联合方案的应用、大剂量化疗和HSCT 的推广，成人急性淋巴细胞白血病的预后已有很大改善，CR 率可达到80% ～ 90%。急性淋巴细胞白血病治疗方案选择需要考虑年龄、急性淋巴细胞白血病亚型、治疗后的MRD 和耐药性、是否有干细胞供体及靶向治疗的药物等。

①诱导缓解治疗。长春新碱（VCR）和泼尼松（P）组成的VP方案是急性淋巴细胞白血病诱导缓解的基本方案。VP 方案能使50%的成人急性淋巴细胞白血病获CR，CR 期3 ～ 8 个月。VCR 主要毒副作用为末梢神经炎和便秘。VP 加蒽环类药物（如柔红霉素，DNR）组成DVP 方案，CR 率可提高至70% 以上，但蒽环类药物有心脏毒性作用，对儿童尤甚。DNR、阿霉素、去甲氧柔红霉素（IDA）、表柔比星的累积量分别达1000mg/m2、500 mg/m2、300 mg/m2 和900mg/m2 时，心脏毒性风险为1% ～ 10%。DVP 再加门冬酰胺酶（L-ASP）即为DVLP 方案，L-ASP 提高患者DFS，是大多数急性淋巴细胞白血病采用的诱导方案。L-ASP 的主要副作用为肝功能损害、胰腺炎、凝血因子及白蛋白合成减少和过敏反应。

在DVLP 基础上加用其他药物，包括环磷酰胺（CTX）或阿糖胞苷（Ara-C），可提高T-ALL 的CR 率和DFS。成熟B-ALL 和ALL-L3 型采用含大剂量（HD）CTX 和HD MTX（甲氨蝶呤）方案反复短程强化治疗，总生存率已由不足10% 达到50% 以上。伴有（t 9；22）的急性淋巴细胞白血病可以合用伊马替尼进行靶向治疗。

②缓解后治疗。缓解后强化巩固、维持治疗和中枢神经系统白血病（CNSL）防治十分必要。如未行异基因HSCT，急性淋巴细胞白血病巩固维持治疗一般需3 年。定期检测MRD 并根据亚型决定巩固和维持治疗强度和时间。L-ASP 和HD MTX 已广为应用并明显改善了治疗结果。HD MTX 的主要副作用为黏膜炎、肝肾功能损害，故在治疗时需要充分水化、碱化和及时亚叶酸钙解救。大剂量蒽环类、依托泊苷和Ara-C 在巩固治疗中作用，尤其是远期疗效仍待观察。

对于急性淋巴细胞白血病，即使经过强烈诱导和巩固治疗，仍需维持治疗。巯嘌呤（6MP）和MTX 联合是普遍采用的有效维持治疗方案。

一般控制白细胞在3×109/L 以下，以控制MRD。为预防CNSL，鞘内注射MTX 10mg，每周一次，至少6 次。

复发指CR 后在身体任何部位出现可检出的白血病细胞，多在CR 后两年内发生，以骨髓复发最常见。此时可选择原诱导化疗方案再诱导，如DVP 方案，CR 率可达29% ～ 69%。若选用HD Ara-C联合米托蒽醌（NVT）或其他药物如氟达拉滨，效果更好。如复发在首次CR 期18 个月后，再次诱导化疗缓解概率相对高。但急性淋巴细胞白血病一旦复发，不管采用何种化疗方案和再缓解率多高，总的二次缓解期通常短暂（中位2 ～ 3 个月），长期生存率

髓外白血病中以CNSL 最常见。单纯髓外复发者多能同时检出骨髓MRD，血液学复发会随之出现。因此在进行髓外局部治疗的同时，需行全身化疗。对CNSL 预防有颅脊椎照射和腰穿鞘注两种方法。颅脊椎照射疗效确切，但其不良反应继发肿瘤、内分泌受损、认知障碍和神经毒性限制了应用。现在多采用早期强化全身治疗和鞘注预防CNSL 发生，以省略颅脊椎照射，将其作为CNSL 发生时的挽救治疗。一旦发生CNSL，未接受过照射者采用HD MTX（或HDAra-C）联合CNS 照射，至少半数病例有效；否则可联合鞘内给药。

HSCT 对治愈成人急性淋巴细胞白血病至关重要。异基因HSCT可使40% ～ 65% 的患者长期存活。主要适应证为：复发难治急性淋巴细胞白血病；CR2 期急性淋巴细胞白血病；CR1 期高危急性淋巴细胞白血病：如染色体为t（9；22）、t（4；11）、＋ 8 者；WBC>30×109/L的前B-ALL和100×109/L的T-ALL；获CR时间>4～6周，CR 后MRD 偏高，在巩固维持期持续存在或仍不断增加。

（2）急性髓细胞白血病治疗。近年来，由于强烈化疗、HSCT 及有力的支持治疗，60 岁以下急性髓细胞白血病患者的预后有很大改善，30% ～ 50% 的患者可望长期生存。

①诱导缓解治疗。

DA（3+7）方案：DNR 每日 45mg/m2 静脉注射，第1 ～ 3 天；每日Ara-C 100 mg/m2，持续静脉滴注，第1 ～ 7 天。60 岁以下患者，总CR 率为63%（50% ～ 80%）。用NVT 每日8 ～ 12 mg/m2 替代DNR，效果相等，但心脏毒性低。用IDA 每日 12 mg/m2 代替DNR，年轻患者中CR 率增加。IDA+Ara-C+VP16 联合应用可使年轻急性髓细胞白血病患者获得80%CR 率。HD Ara-C 方案不增加CR 率，但对延长缓解期有利。剂量增加的诱导化疗能提高疗程CR 率和缓解质量，但相关毒性亦随之增加。国内创用HOAP 或HA（高三尖杉酯碱每日3 ～ 6mg，静脉滴注5 ～ 7 天）方案诱导治疗急性髓细胞白血病，CR 率为60% ～ 65%。1 个疗程获CR 者DFS 长，经过2 个疗程诱导才达CR 者5 年DFS 仅10%。达CR 所用的诱导时间越长则DFS 越短。2 个标准疗程仍未CR 者提示患者原发耐药存在，需换方案或进行异基因HSCT。

急性早幼粒细胞白血病患者采用ATRA 每日25 ～ 45 mg/m2 口服治疗直至缓解。ATRA 可诱导带有t（15；17）（q22；q21）/PMLRARα融合基因的早幼粒白血病细胞分化成熟。ATRA ＋化疗的CR率为70% ～ 95%，同时降低“维A 酸综合征”的发生率和亡率。

维A 酸综合征多见于急性早幼粒细胞白血病单用ATRA 诱导过程中，发生率为3% ～ 30%，发生机制可能与细胞因子大量释放和黏附分子表达增加有关。临床表现为发热、体重增加、肌肉骨骼疼痛、呼吸窘迫、肺间质浸润、胸腔积液、心包积液、皮肤水肿、低血压、急性肾功能衰竭甚至亡。初诊时白细胞较高及治疗后迅速上升者易发生ATRA 综合征。治疗包括暂时停服ATRA，吸氧，利尿，地塞米松10mg 静脉注射，每日2 次，白细胞单采清除和化疗等。

ATRA 的其他不良反应为头痛、颅内压增高、骨痛、肝功能损害、皮肤与口唇干燥、阴囊皮炎溃疡等。急性早幼粒细胞白血病常伴有原发纤溶亢进，合并出血者除服用ATRA 外，还需抗纤溶治疗，补充凝血因子和血小板。如有弥散性血管内凝血，可酌情应用小剂量肝素。对高白细胞的急性早幼粒细胞白血病，也可将砷剂作为一线药物。砷剂小剂量能诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化、大剂量则诱导其凋亡。成人用0.1% 的As2O3（亚砷酸）注射液10ml 稀释于5%GS 或NS 250 ～ 500ml 中静脉滴注3 ～ 4 小时，儿童剂量按体表面积每日6mg/m2，每日一次，4 周为一疗程，每疗程可间隔5 ～ 7 天，亦可连续应用，连用2 个月未CR 者应停药。

②缓解后治疗。诱导CR 是急性髓细胞白血病长期DFS 关键的第一步，但此后若停止治疗，则复发几乎不可避免。复发后不行HSCT 则生存者甚少。急性髓细胞白血病缓解后治疗的特点为：急性髓细胞白血病的CNSL 发生率仅2%，初诊高白细胞、伴髓外病变、M4/M5、t（8；21）或inv（16）、CD7+ 和CD56+ 者应在CR 后做脑脊液检查并鞘内预防性用药。国内多数单位在急性髓细胞白血病 CR后仍将CNSL 预防列为常规，鞘内注药至少1 次，但较急性淋巴细胞白血病预防次数明显减少；急性髓细胞白血病比急性淋巴细胞白血病治疗时间明显缩短，急性早幼粒细胞白血病用ATRA 获得CR后采用化疗与ATRA 或砷剂交替维持治疗2 ～ 3 年较妥。

高危组首选异基因HSCT；低危组（不含APL）首选HD Ara-C为主的强烈化疗，复发后再行异基因HSCT；中危组强化疗、大剂量化疗+ 自体HSCT 或同胞相合HSCT 均可。值得注意的是在属于中危组的正常核型急性髓细胞白血病中，也存在基因突变，NPM1 和CEBPA 突变对预后有利，而FLT3-ITD、MLL-PTD 突变等对预后不利。

HD Ara-C 方案巩固强化，每剂Ara-C 静脉滴注3 小时，连用6 ～ 12 个剂量，可单用或与安吖啶、NVT、DNR、IDA 等联合使用。

急性髓细胞白血病用HD Ara-C 巩固强化至少4 个疗程，或1 次HDAra-C 后行自身HSCT，长期维持治疗已无必要。HD Ara-C 的最严重并发症是小脑共济失调，发生后必须停药。皮疹、发热、眼结膜炎也常见，可用糖皮质激素常规预防。因贫困，年龄>55 岁或有并发症不能采用上述治疗者，也可用常规剂量的不同药物组成化疗方案，每1 ～ 2 个月轮换巩固维持2 年，但仅约10% ～ 15% 的患者能够长期生存。

③复发和难治急性髓细胞白血病的治疗。

HD Ara-C 联合化疗：对年龄55 岁以下，支持条件较好者，可选用之。

新方案：如氟达拉滨、Ara-C 和G-CSF±IDA（FLAG±I）。

对于年龄偏大或继发性急性髓细胞白血病，可采用预激化疗：

G-CSF 每日300μg 皮射，1 ～ 14 天；阿克拉霉素每日20mg，静脉注射，1 ～ 4 天；Ara-C 10 ～ 15mg/m2，每12 小时1 次，皮射，1 ～ 14 天。

HSCT：除HLA 相合的HSCT 外，还包括HLA 部分相合或半相合的移植。

免疫治疗：非清髓性干细胞移植（NST）、供体淋巴细胞输注（DLI）、抗CD33 和CD45 单抗也显示了一定的疗效。

（3）老年急性白血病的治疗。大于60 岁，由MDS 转化而来、继发于某些理化因素、耐药、重要器官功能不全、不良核型者，更应强调个体化治疗。多数患者化疗需减量用药，以降低治疗相关亡率，少数体质好，支持条件佳者可采用类似年轻患者的方案治疗，有HLA 相合同胞供体者可行NST。

Debye散射是

自然选育的菌种来源于自然界、菌种保藏机构或生产过程，从自然界中选育菌种的过程较为复杂，而从生产过程或菌种保藏机构得到菌种的自然选育过程较为简单。

自然选育的步骤主要是：采样，增长培养，培养分离和筛选等。采样　筛选的菌种采集的对象以土壤为主，也可以是植物、腐败物品和某些水域等。土壤是微生物的汇集地，从土壤中几乎可以分离到任何所需的微生物，故土壤往往是首选的采集目标。微生物的营养需求和代谢类型与生长环境有很大关系。富集培养　由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，若估计到要分离的菌种数量不多时，就要人为增加分离的概率，增加该菌种的数量，称为富集培养。纯种培养尽管通过增长培养的效果很好，但是得到的微生物还是处于混杂状态，因为样品中本身含有许多种类的微生物。所以，为了取得所需的微生物纯种，增殖培养后必须进行分离。平板分离法由接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。分离方法有三种：即划线分离法、稀释法和组织分离法。稀释分离法　在溶液中再加入溶剂使溶液的浓度变小。亦指加溶剂于溶液中以减小溶液浓度的过程。浓溶液的质量×浓溶液的质量分数=稀溶液的质量×稀溶液的质量分数生产能力考察　初筛一般通过平板稀释法获得单个菌落，然后对各个菌落进行有关性状的初步测定，从中选出具有优良性状的菌落。例如，对抗生素产生菌来说，选出抑菌圈大的菌落；对于蛋白酶产生菌来说，选出透明圈大的菌落。此法快速、简便，结果直观性强。缺点是培养皿的培养条件与三角瓶、发酵罐的培养条件相差大，两者结果常不一致。

复筛指对初筛出的菌株的有关性状作精确的定量测定。一般要在摇瓶或台式发酵罐中进行培养，经过精细的分析测定，得出准确的数据。突变体经过筛选后，还必须经过小型或中型的投产试验，才能用于生产。诱变育种诱变育种一般步骤利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，扩大变异幅度，通过一定的筛选方法，获得所需要优良菌株的过程，称为诱变育种。诱变育种应注意的问题（1）挑选优良的出发菌株出发菌株就是用于育种的原始菌株。出发菌株适合，育种工作效率就高。参考以下实际经验选用出发菌株：①以单倍体纯种为出发菌株，可排除异核体和异质体的影响；②采用具有优良性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株。由于有些菌株在发生某一变异后，会提高对其它诱变因素的敏感性，故可考虑选择已发生其他变异的菌株为出发菌株。④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。

（2）菌悬液的制备一般采用生理状态一致（用选择法或诱导法使微生物同步生长）的单细胞或孢子进行诱变处理。所处理的细胞必须是均匀而分散的单细胞悬液。分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。由于某些微生物细胞是多核的，即使处理其单细胞，也会出现不纯的菌落。有时，虽然处理的是单核的细胞或孢子，但由于诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变无法反映在当代的表型上，而是要经过DNA的复制和细胞分裂后才表现出来，于是出现了不纯菌落，这就叫表型延迟。上述两类不纯菌落的存在，也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后很快出现生产性状“衰退”的主要原因。鉴于上述原因，因此用于诱变育种的细胞应尽量选用单核细胞，如霉菌或放线菌的孢子或细菌的芽孢。

细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响。细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。

（3）选择简便有效、最适剂量的诱变剂诱变剂主要有两大类，即物理诱变剂和化学诱变剂。物理诱变剂如紫外线、X射线、γ射线和快中子等；化学诱变剂种类极多，主要有烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物。最常用的烷化剂有N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS) 、甲基亚硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)和环氧乙烷等。目前常用的诱变剂主要有紫外线(UV)、硫酸二乙酯、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝基甲基脲(NMU)等。后两种因有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”。剂量的选择受处理条件、菌种情况、诱变剂的种类等多种因素的影响。剂量一般指强度与作用时间的乘积。在育种实践中，常采用杀菌率来作各种诱变剂的相对剂量。要确定一个合适的剂量，通常要进行多次试验。在实际工作中，突变率往往随剂量的增高而提高，但达到一定程度后，再提高剂量反而会使突变率下降。根据对紫外线、X射线和乙烯亚胺等诱变效应的研究结果，发现正变较多地出现在偏低的剂量中，而负变则较多地出现于偏高的剂量中，还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变。因此，在诱变育种工作中，目前比较倾向于采用较低的剂量。例如，过去在用紫外线作诱变剂时，常采用杀菌率为99%的剂量，而近年来则倾向于采用杀菌率为30%～75%的剂量。

（4）突变体的筛选诱变处理使微生物群体中出现各种突变型，其中绝大多数是负变株。要获得预定的效应表型主要靠科学的筛选方案和筛选方法，一般要经过初筛和复筛两个阶段的筛选。杂交育种杂交育种法杂交育种（bybridization）指不同种群、不同基因型个体间进行杂交，并在其后代中通过选择而育成纯合品种的方法。杂交可以使双亲的基因重新组合，形成各种不同的类型，为选择提供丰富的材料；基因重组可以将双亲控制不同性状的优良基因结合于一体，或将双亲中控制同一性状的不同微效基因积累起来，产生在各该性状上超过亲本的类型。正确选择亲杂交育种技术选择　1．选择亲本的原则首先要尽可能选用综合性状好，优点多，缺点少，优缺点或优良性状能互补的亲本，同时也要注意选用生态类型差异较大、亲缘关系较远的亲本杂交，如江西的荷包红鲤和云南的元江鲤。在亲本中最好有一个能适应当地条件的品种。要考虑主要的育种目标，选作育种目标的性状至少在亲本之一应十分突出。当确定一个品种为主要改良对象，针对它的缺点进行改造才能收到好的效果，如草鱼的抗病性。采用的组合方式　2.杂交方式亲本确定之后，采用什么杂交组合方式，也关系育种的成败。通常采用的有单杂交、复合杂交、回交等杂交方式。　（1)单杂交即两个品种间的杂交(单交)用甲×乙表示，其后代称为单交种，由于简单易行、经济，所以生产上应用最广，一般主要是利用第一代，如丰鲤、福寿鱼。　（2)复合杂交即用两个以上的品种、经两次以上杂交的育种方法。如果单交不能实现育种所期待的性状要求时，往往采用复合杂交，其目的在于创造一些具有丰富遗传基础的原始群体，才可能从中选出更优秀的个体。复合杂交可分为三交、双交等。三交是一个单交种与另一品种的再杂交，可表示为(甲×乙)×丙，例如(荷包红鲤×元江鲤)×散鳞镜鲤一三杂交鲤。双交是两个不同的单交种的杂交，可表示为(甲×乙)×(丙×丁)或(甲×丙)×(乙×丙)，例如(蓝非鲫×尼罗非鲫)×(莫桑比克非鲫×尼罗非鲫)。　（3)回交即杂交后代继续与其亲本之一再杂交，以加强世代某一亲本性状的育种方法。当育种目的是企图把某一群体乙的一个或几个经济性状引入另一群体甲中去，则可采用回交育种。如鲮鱼具有许多优良性状，但不能耐受低温，需要进行遗传改良。可先用耐受低温的湘华鲮与鲮杂交，杂交子一代再与鲮回交，回交后代继续同鲮进行多次回交，对回交子代选择的注意力必须集中在抗寒性这个目标性状上，从而最终育成一个具有抗寒性的优良的。基因工程育种　随着DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，特别是当人们了解到遗传密码是由RNA转录表达的以后，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。　如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。　这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。　基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。　所谓基因工程（genetic engineering)是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。

western blot做压片是红灯是不是很重要

答案：B

免疫比浊分析法主要用于检测血浆、体液中的特定蛋白系列，如免疫球蛋白、补体、尿微量蛋白系列等；吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标记抗体或抗原的免疫分析法；全自动微孔板式ELISA分析仪是用参与催化某一反应的酶来标记抗原或抗体，常用标记酶有辣根过氧化物酶( HRP)和碱性磷酸酶(ALP)；电化学发光免疫分析仪是采用电化学发光技术、生物素放大技术，以顺磁性微粒为固相载体，用三联吡啶钌标记抗原或抗体，三丙胺( TPA)为电子供体，而设计的一种自动化分析仪器；异硫氰酸荧光素( FITC)是免疫荧光标记最常用的荧光探针。

Rayleigh散射是

红灯是为了照明，因为溴化银底片对蓝紫色光较较敏感而对红光几乎无反应，又因为在暗室，你在可见光下才能操作，红光属于可见光。压片现在的技术主要还是根据化学发光法的原理，具体原理如下：（也是网上查资料查出来的，你也可以自己去查）

发光剂是指在发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，根据上述发光特点可将发光剂分为荧光素、生物发光剂和化学发光剂三种。下面主要叙述化学发光免疫技术中常用的化学发光剂或发光底物。

1）酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物，目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。也就是常常用来标记二抗的HRP和AP。

HRP的发光底物为鲁米诺或其衍生物和对-羟基苯乙酸（HPA）。

AP的发光底物为3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物），CDP-STAR。

（1）鲁米诺或其衍生物:

鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.1mol/L pH8.6Tris缓冲液作底物液。

要注意是:首先,鲁米诺和H2O2在无HRP催化时也能缓慢自发发光，而在最后光强度测定中造成空白干扰，因而宜分别配制成2瓶试剂溶液，只在用前即刻混合;其次, HRP发光增强剂如某些酚试剂（如邻－碘酚）或萤火虫荧光素酶可增强HRP催化鲁米诺氧化的反应和延长发光时间，提高发光敏感度。

（2）对-羟基苯乙酸（HPA）:

对-羟基苯乙酸（HPA）在H2O2存在下被HRP氧化或氧化二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光，可用荧光光度计测量。

（3）AMPPD:

AMPPD在碱性条件下，被ALP酶解生成相当稳定的AMP-D阴离子，其有2-30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度达到高峰，15-60min内光强度保持相对稳定。

（4）4-MUP:

4-MUP被ALP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的激发光的作用下，发出448nm的荧光，用荧光光度计进行测量。

（5）CDP-STAR试剂

CDP-Star是通过dioxetane在碱性磷酸酶的激活作用下以持续的速度发出光信号来进行检测，灵敏度高，发光时间从几分钟开始可以延续数天，所以可多次曝光并对曝光时间进行优化。是目前最快速、最灵敏的化学发光底物，曝光时间只需15-60秒。当在尼龙膜上以1:100稀释在检测缓冲液中时，CDP-Star的光信号可以在15分钟内达到最大并且缓衰减达3天以上。特别适用于检测哺乳动物的单拷贝基因、检测极少量的靶DNA，如制作指纹图谱及法医分析。

2）直接化学发光剂这类发光剂不需酶的催化作用，只需改变溶液的pH等条件就能发光的物质，如吖啶酯（acridinium, AE）在有过氧化氢的稀碱溶液中即能发光。

3）电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+（图16-7）和电子供体三丙胺（TPA）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，成为强氧化剂，TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+，它很不稳定，可自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA.，成为一种很强的还原剂，可将一个高能量的电子递给三价的[Ru(bpy)3]3+使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+.。激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出一个波长为620nm的光子，回复到基态的三联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强。

3.化学显色法

1）HRP-DAB显色法:

①DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C各1滴,混匀.

②显色:将适量DAB显色液平铺在Ab2杂交后的印迹膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色带

③终止:用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应.

2）AP-NBT/BICP显色法：

每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。

4.底物化学发光ECL（一些具体操作）

（1）HRP-ECL发光法：

将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

（2）AP的发光自显影：

AP的发光底物是金刚烷二氧丁环磷酸盐（AMPPD），它含有磷酸酯键在AP的作用下水解下一个磷酸，进而由分子内过氧键提供能源分解产生金刚酮和激发态的甲基间-氧苯甲酸阴离子，当此阴离子恢复到基态时发出光子。可用波拉黑白片（621型）直接暴光显影。显影信号强度比BCIP/NBP显色法强两上数量级。是很前景的显示体系。

5.其他

酶促反应比同位素安全且快速，已经成为Western Blot的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高——随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pg级别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase）：

一、HRP：

HRP 辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物2大类:

1. 化学发光底物：

化学发光底物主要考虑的是：发光信号强弱——发光信号当然越强越好，强发光信号持续的时间——也是越长越好，还有就是背景低灵敏度高。

Luminol是经典的HRP化学发光底物。GE Healthcare（原安玛西亚）的ECL堪称是经典。

除了拥有王牌产品ECL的GE公司，化学发光底物方面不得不提到Pierce公司。Pierce拥有世界上最优秀的HRP化学发光底物生产技术——世界上许多知名的化学发光底物试剂盒厂商都采用PIERCE提供的化学发光底物作为生产原料。其中最耀眼的璀璨之星是SuperSignal系列。

SuperSignal灵敏度高（有10{-12}g级，10{-14}g级，10{-15}g 级选择），发光持久（6-24小时），可反复曝光，稳定性好（室温贮藏6个月，4℃至少是12个月），节约抗体（由于灵敏度高，一抗二抗稀释倍数是同类产品的10倍以上，这对于宝贵一抗来说十分重要）。

2.生色底物：

HRP的生色底物显色有DAB，4-CN ，CN/DAB，AEC和TMB等（而得到可溶性产物的底物如OPD，ABTS等则适用于ELISA）中，与化学发光法中的酶促基团发光不同，底物显色主要是利用底物在有HRP和过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测WB的结果。

最熟悉的底物应该是3’3′二氨基联苯胺DAB，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒。

二、AP：

Western Blot检测系统中常用交联酶两大家族中的另外一类就是AP——碱性磷酸酶。碱性磷酸酶很早就被用于检测系统——包括固定化抗原（WB）检测和核酸检测。

但是做过AP实验的经常会遇到膜上显色背景偏高的问题，所以就WesternBlot本身来说偏爱HRP的要比AP多——分子克隆III解释说由于在我们常用的封闭剂：脱脂奶粉和牛血清白蛋白BSA中富含AP，这样当然显色背景会高。所以分子克隆III推荐的AP适用封闭剂是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol EDTA 65度加热一小时确保AP失活后再用于封闭。

一些研究的样本自身也含有较高水平的碱性磷酸酶，虽然实验上很容易实现抑制内源AP影响，但实际上容易被忽略。AP显色底物生成的产物主要是蓝紫色，成像性好容易拍照。早些年前，AP检测的灵敏度比HRP高，但是背景也偏高，整个显色过程更有“技术性”，有许多个人技巧在里面，让人取舍两难。

如今由于HRP的化学发光底物已经不断改进而使得灵敏度不断提高，化学发光显色上HRP和AP不相上下，但是生色反应来说，AP显色的灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。

AP作为一种经典常用的显色交联酶，自有其优点，比如AP的底物显然更稳定，不像HRP那样需要新鲜配制的H2O2一类的不稳定成分，作为试剂盒可以保存时间更长，特别是习惯用显色方法检测WB结果的。就像HRP可以用于化学发光和底物显色一样，AP也有这两种常用的检测方法的不同底物。AP显色的灵敏度就已经可以达到低皮克级，前提是封闭要做得好。常用的是BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3’-Indolyphosphate p-Toluidine Salt) ，NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride)和INT。

几乎出显色剂的厂家都会生产到这几种底物，比如Roche的BCIP和INT/BCIP ，Pierce的BCIP/NBT，其中以BCIP/NBT灵敏度最高，显色也比较锐利，成像性比较好，因此也就最常用到。预配的即用型显色底物不存在颗粒性底物，较少产生斑点背景。NEB和Initrogen也有完整的检测试剂盒。

最常用的是HRP+GE healthcare得ECL曝光显色试剂。

答案：A